海藻糖酶產(chǎn)生菌的選育、鑒定及其酶學(xué)特性初探

董哲卿， 張新爽， 肖光焰， 董 琦， 郭鴻飛,， 龔勁松， 史勁松， 許正宏

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學(xué)藥學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇博揚(yáng)生物制品有限公司，江蘇 南通 226000)

海藻糖(Trehalose)是由2分子吡喃葡萄糖環(huán)以α，α-1,1-糖苷鍵連接而成的一種十分穩(wěn)定的非還原二糖。H.A.Wiggers于1832年在研究黑麥中的麥角菌時，第一個發(fā)現(xiàn)了海藻糖；Mitscherlich隨后于1858年在蘑菇中分離到了這種糖，并稱其為海藻糖。海藻糖在自然界中普遍存在，且分布范圍比較廣，包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、低等植物、脊椎動物，特別在真菌和昆蟲中的含量非常高，是國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一[1]。雖然海藻糖的來源廣泛，但能在體內(nèi)大量積累海藻糖的生物并不是很多。海藻糖的分解途徑在真菌中研究得比較透徹，國內(nèi)外研究成果表明，除畢赤酵母利用海藻糖磷酸化酶分解海藻糖外，其余所有真菌對海藻糖的分解都是通過以海藻糖為專一底物的海藻糖酶的水解反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。海藻糖酶是一種海藻糖水解酶，能夠?qū)Ｒ恍圆⑻禺愋缘膶?分子海藻糖分解為2分子的葡萄糖。自然界中，海藻糖酶廣泛存在于昆蟲、哺乳動物、微生物和植物中，并發(fā)揮著重要的作用；在食品、農(nóng)業(yè)、農(nóng)藥以及昆蟲處理中應(yīng)用前景巨大，特別是在乙醇工業(yè)中，海藻糖酶可改善發(fā)酵糖質(zhì)原料中二糖組分的利用效率，提高目標(biāo)產(chǎn)物乙醇的收率，尤其是發(fā)酵結(jié)束時減小“DP2峰”(DP-聚合度-等同于二糖)海藻糖的總量，可大大提高殘?zhí)堑睦寐屎涂偺堑霓D(zhuǎn)化率。海藻糖酶最早是Bourquelot于1893年在黑曲霉中發(fā)現(xiàn)的，1895年Fischer在釀酒酵母里也發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶[2]。隨后，科研人員在不同的生物里不斷地發(fā)現(xiàn)和鑒定了不同的海藻糖酶，這些生物包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、線蟲等。真菌中的海藻糖酶因反應(yīng)的最適pH值差異性被分為兩類：中性海藻糖酶和酸性海藻糖酶。其中酸性海藻糖酶位于液泡，是胞外酶，不能被磷酸化調(diào)控，最適pH值在4.5左右；而中性海藻糖酶位于細(xì)胞質(zhì)，負(fù)責(zé)主要的胞內(nèi)海藻糖分解，最適pH值在7.0左右。目前有關(guān)海藻糖酶產(chǎn)生菌種的報道較少，應(yīng)用特性也無法滿足生產(chǎn)需求，本研究以經(jīng)海藻糖馴化的土壤進(jìn)行產(chǎn)酶菌種的分離選育，并利用形態(tài)學(xué)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定篩選到的目標(biāo)菌株。通過酶學(xué)性質(zhì)探討在不同條件下目標(biāo)菌株產(chǎn)海藻糖酶的影響因素和應(yīng)用性能，以期為海藻糖酶在乙醇生產(chǎn)中的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 菌種篩選土樣采自無錫長廣溪濕地公園、江南大學(xué)附近經(jīng)海藻糖馴化的土壤。用小鏟子鏟去表層土，采集深5～10 cm處的土壤約50 g，裝入消毒的塑料袋密封并記錄時間、地點(diǎn)、環(huán)境情況。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①富集培養(yǎng)基：蛋白胨 5，酵母膏 1.5，葡萄糖 150，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.5。②初篩培養(yǎng)基：海藻糖 15，KCl 1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO31，瓊脂20，pH 7.0。③液體發(fā)酵培養(yǎng)基：海藻糖 15，KCl 1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO31，pH 7.0。④LB培養(yǎng)基。

1.1.3 酶活測定試劑 ①DNS試劑：準(zhǔn)確稱取244.4 g酒石酸鉀鈉于500 mL去離子水中，45 ℃加熱溶解，溶液中加入21 g NaOH，然后加入6.3 g DNS ，溶解后按順序分別加入5 mL苯酚和5 g NaHSO3，待溶液冷卻后定容至1 L。將配制好的DNS溶液于棕色瓶中避光貯存，放置1周后使用。②50 mmol/L H3PO4緩沖液：分別配制200 mmol/L的NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液母液(兩者比例分別為68.5%和31.5%)，將母液稀釋配制成50 mmol/L、pH 6.5的PBS緩沖液。③100 mg/mL海藻糖溶液：以50 mmol/L的PBS緩沖液為溶液，加入海藻糖，溶解后配制成10%海藻糖母液，作為酶活測定底物備用。

1.1.4 酶學(xué)性質(zhì)研究試劑 ①BR(Britton-Robinson)緩沖溶液：在100 mL H3PO4、H3BO3和CH3COOH 三種酸(濃度均為 0.04 mol/L)的混合液中，向其中加入不同體積的NaOH(濃度為0.2 mol/L)調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值為1.8～11.9，10%海藻糖底物溶液由上述緩沖液配制而成，酶液由上述緩沖液進(jìn)行適度稀釋。②金屬離子溶液：將Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+、Fe2+、Sn2+、Ba2+、Mg2+、Co2+和Li+等各金屬離子配制成濃度為200 mmol/L的母液。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集篩選 取5 g新鮮土樣充分震蕩懸浮于45 g無菌水中，取1 mL土壤懸液上清放入含富集培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。取1 mL經(jīng)富集培養(yǎng)的菌液移入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在漩渦震蕩器上震蕩搖勻制成10-1濃度的樣品懸浮液；再從上述懸浮液中吸取1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，震蕩搖勻制成10-2濃度的樣品懸浮液，依次配制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度的樣品懸浮液。各取0.1 mL的樣品懸浮液涂布于初篩培養(yǎng)基上，每個濃度2個重復(fù)，選取菌落分散，單菌落數(shù)目在100～200左右的平板作為目標(biāo)平板。復(fù)篩時，將菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)36 h后即得粗酶液，用于酶活測定。根據(jù)酶活篩選出具有較高海藻糖酶活力的菌株，待測菌株編號C2。

1.2.2 酶活檢測方法 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定海藻糖酶分解海藻糖產(chǎn)生的葡萄糖含量：取2 mL EP管，依次加入150 μL稀釋后的粗酶液和150 μL 10%的可溶性海藻糖底物做為實(shí)驗(yàn)組；依次加入150 μL稀釋后的酶液和150 μL pH 6.5的磷酸緩沖液，37 ℃反應(yīng)15 min作為對照組；實(shí)驗(yàn)組和對照組各加入300 μL的DNS試劑，沸水浴5 min終止反應(yīng)，取出置于冰水混合物中冰浴2 min；取200 μL混合液在540 nm 測定其吸光度值。準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥至恒重的無水葡萄糖，溶于去離子水中，并定容至100 mL，即為10.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，按照表1配制不同濃度的葡萄糖溶液，加入300 μL的DNS試劑進(jìn)行反應(yīng)，于540 nm測定其吸光度值，制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照組以pH 6.5的PBS緩沖液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液[4]。酶活計算方法：酶活(1 U)定義為在上述實(shí)驗(yàn)條件下，1 mL的酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量，測定均重復(fù)3次。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.3 菌種鑒定 收集液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體，選擇16S rDNA 通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R(GGTTACCTTGTTAC-GACTT)對所提細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于200 μL PCR管配制50 μL PCR 反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系：ExTaqDNA聚合酶預(yù)混液(Takara)25 μL、基因組2 μL、上游引物27F 1 μL、下游引物1492R 1 μL、ddH2O 21 μL，混勻后，稍微離心使溶液完全處于PCR 管底部，將PCR管放入PCR儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)30次，72 ℃終止延伸10 min，擴(kuò)增完成后，凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增結(jié)果。以1×TBE 緩沖液為電泳液，10×Loading buffer染色，5 000 DL DNA Maker 為標(biāo)準(zhǔn)Maker，150 V運(yùn)行30 min，凝膠成像儀觀察1 500 bp 處有明亮條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化按上海生工生物技術(shù)公司的小量膠回收PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行，使用Thermo NanoDrop 2000 測定所提基因組的濃度，測序由上海睿迪生物科技有限公司完成。利用生化鑒定法(革蘭染色法)對菌種做進(jìn)一步的鑒定[5-6]，根據(jù)微生物實(shí)驗(yàn)手冊對菌株進(jìn)行革蘭染色，光學(xué)顯微鏡和電鏡進(jìn)行菌體形態(tài)觀察[7-8]。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究 ①最適反應(yīng)溫度研究：用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.5)適度稀釋酶液，分別在30、35、40、45、50、55 ℃條件下測定海藻糖酶酶活，以最高酶活的反應(yīng)溫度作為最適反應(yīng)溫度。②溫度穩(wěn)定性測定：將酶液在不同溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)條件下熱處理30 min后置冰上冷卻，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法在37 ℃測定海藻糖酶剩余酶活，以未經(jīng)處理酶液的酶活作為對照。③最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性研究：在不同緩沖液體系下按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法進(jìn)行酶活檢測，以最高酶活的反應(yīng)pH值作為最適反應(yīng)pH值。④pH值穩(wěn)定性測定：將酶液置于不同pH值緩沖液中并于冰上放置1 h，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行酶活檢測，以未經(jīng)處理酶液的酶活作為對照。⑤金屬離子對酶活的影響：分別配制200 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+、Fe2+、Sn2+、Ba2+、Mg2+、Co2+和Li+等金屬離子母液，以1 mmol/L的終濃度分別置入海藻糖酶酶活檢測反應(yīng)體系，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)酶活檢測反應(yīng)，以不加任何金屬離子的反應(yīng)作為對照。⑥化學(xué)試劑對酶活的影響：分別配制10%吐溫(Tween-20、Tween-80)、曲拉通(Tritonx-100、Tritonx-114)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和二甲基亞砜(DMSO)的溶液，以1%終濃度置入酶活檢測反應(yīng)體系進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)酶活檢測反應(yīng)；將乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)等分別配制成200 mmol/L母液，分別按照1 mmol/L終濃度加入到反應(yīng)體系后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)酶活檢測反應(yīng)，以上反應(yīng)均以不加任何化學(xué)試劑作為對照[9-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及生理學(xué)特性鑒定

將篩選到的菌株C2在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌落圓形、隆起、灰白色，易挑取(圖1)。革蘭染色為紅色，光學(xué)顯微鏡觀察，菌體多呈直桿狀，大小在(0.5～1.0)μm×(1.0～3.0)μm左右，單生或成對，有時短鏈狀(圖2)。電鏡觀察進(jìn)一步確認(rèn)了該菌株的形態(tài)(圖3)。該菌株為革蘭陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，利用果糖、半乳糖、D-葡萄糖、β-甲基葡萄糖苷和蔗糖產(chǎn)酸?？衫帽猁}、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、蘋果酸鹽作為惟一的碳源和能源，不能利用苯甲酸鹽、草酸鹽或丙酸鹽。以終濃2.5%的海藻糖度對該海藻糖酶的全細(xì)胞蛋白進(jìn)行酶活測定，酶活可達(dá)17.99 U/mL。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株C2的16S rDNA序列長度為1 409 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列BLAST比對確定其種屬。最終結(jié)果顯示，該菌株的16S rDNA序列與Erwinia屬(HM748066.1、MG198678.1等)的相關(guān)序列存在99%以上的同源性，與Pantoea屬(KM019845.1)的相關(guān)菌株序列同源性為98%左右，最終將其歸為Erwinia屬。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)，編號為C2，該菌株已保藏在中國普通微生物保藏管理中心(保藏編號CGMCC No.16760)(圖4)。

圖1 菌株C2培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Strain morphology of C2 on plates

圖2 菌株C2光學(xué)顯微鏡形態(tài)(100×)Fig.2 Strain morphology of C2 under light microscope (100×)

圖3 菌株C2電鏡形態(tài)Fig.3 Strain morphology of C2 under electron microscope

2.3 海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 研究發(fā)現(xiàn)菌株C2的海藻糖酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在35～45 ℃相對酶活達(dá)到90%以上；在30～35 ℃熱穩(wěn)定性較高，殘余酶活可保持在90%以上，超過40 ℃，熱穩(wěn)定性明顯下降(圖5)。

2.3.2 最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性研究 在不同緩沖液體系下按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法進(jìn)行酶活檢測，以最高酶活反應(yīng)的pH值作為最適pH值。研究發(fā)現(xiàn)該海藻糖酶的最適pH值為5.0，海藻糖酶在酸性環(huán)境下具有較高酶活，尤其在pH值4.5～5.5時，相對酶活仍可達(dá)90%以上；pH值穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，該酶在pH值為4.0～9.0時均能保持80%以上的殘余酶活，具有良好的穩(wěn)定性，這一特性應(yīng)用于乙醇工業(yè)生產(chǎn)，可提高殘?zhí)堑睦寐屎涂偺堑霓D(zhuǎn)化率(圖6)。

2.3.3 金屬離子和化學(xué)試劑對海藻糖酶活性影響 金屬離子對酶活影響的研究結(jié)果表明，與對照相比，Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+對酶活有促進(jìn)作用，而Sn2+和Ba2+對酶活有抑制作用，Mg2+、Co2+和Li+對酶活力幾乎沒有影響(表2)。

不同化學(xué)試劑，包括表面活性劑、酶抑制劑、金屬螯合劑等對酶活影響的結(jié)果顯示，與對照相比，DMSO和DTT對酶活有促進(jìn)作用，而Triton X-114、SDS和PMSF對酶活有抑制作用，Tween-20、Tween-80、Triton X-100和EDTA對酶活幾乎沒有影響(表3)。

表2 金屬離子對海藻糖酶酶活性的影響

表3 化學(xué)試劑對海藻糖酶酶活性的影響

圖4 基于neighbor-joining方法構(gòu)建大黃歐文氏菌(E. rhapontici)16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis results based on the 16S rDNA sequence of E. rhapontici based on neighbor-joining method 種屬名稱前的編號為相應(yīng)基因序列在GenBank中的登錄號，步長值根據(jù)1 000次重復(fù)計算獲得Numbers before the strain name are accession numbers of published sequences in GenBank， bootstrap values were based on 1 000 replicates

圖5 大黃歐文氏菌(E. rhapontici)海藻糖酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.5 Optimum temperature and thermo-stability oftrehalase produced by E. rhapontici

圖6 大黃歐文氏菌(E. rhapontici)海藻糖酶的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.6 Optimum pH and pH stability of trehalase produced by E. rhapontici

3 討 論

海藻糖酶在食品、工業(yè)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[12-13]，但目前產(chǎn)酶菌以及海藻糖酶酶學(xué)特性研究報道較少。特別在工業(yè)生產(chǎn)中，海藻糖酶可以改善發(fā)酵原料利用效率以提高產(chǎn)物乙醇的收率，能夠大大提高殘?zhí)堑睦寐屎涂偺堑霓D(zhuǎn)化率。因此，海藻糖酶的菌種選育及酶學(xué)性質(zhì)研究有著潛在的理論意義和實(shí)踐價值。本研究在對大黃歐文氏菌海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究過程中發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)條件為40 ℃、pH值5.0，該海藻糖酶在酸性條件下較穩(wěn)定，35 ℃以下熱穩(wěn)定性較高；添加金屬離子如Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+以及化學(xué)試劑DMSO和DTT對酶活力均有促進(jìn)作用，Triton X-114、SDS和PMSF對酶活力有抑制作用。

目前，有關(guān)海藻糖的相關(guān)代謝酶類研究主要是針對海藻糖合成酶并已有大量報道[14-17]，而有關(guān)水解海藻糖的海藻糖酶則報道較少，已有的海藻糖酶主要來源于昆蟲，如棉鈴蟲 (Helicoverpaarmigera)[18-19]、小菜蛾(Plutellaxylostella(Linnaeus))[5]、煙粉虱 (Bemisiatabaci)[20]、綠盲蝽 (Apolyguslucorum)[21]等，而微生物來源的海藻糖酶則鮮有報道。

于林港等[22]以大腸埃希菌E.colistr.K-12 substr. MG1655基因組為模板，擴(kuò)增獲得1種海藻糖酶基因tref，經(jīng)大腸表達(dá)宿主E.coliBL21 (DE3)中重組表達(dá)，對重組菌進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化和IPTG誘導(dǎo)后，重組海藻糖酶的酶活最高達(dá)到107 U/mL，該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適pH值為7.0。馬俊等[23]以4齡小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)體內(nèi)海藻糖酶為研究對象，在離體條件下的研究結(jié)果表明，小菜蛾體內(nèi)海藻糖酶的最適反應(yīng)pH值為6.0，溫度50 ℃。譚永安等[21]以綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶 (ALTre-2)基因?yàn)檠芯磕繕?biāo)，構(gòu)建了ALTre-2原核表達(dá)載體 (pET28a-ALTre-2)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析顯示該蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性后發(fā)現(xiàn)重組ALTre-2蛋白在pH值7.0時活性最高，最適反應(yīng)溫度為50 ℃。Ai等[5]對棉鈴蟲 (H.armigera)海藻糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該酶在最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適pH值為6.0的條件下，酶活性為1.62 U/mg。于彩虹等[18]對昆蟲組織中海藻糖酶活性測定結(jié)果顯示，亞洲玉米螟、棉鈴蟲腸中海藻糖酶的活性最高，分別為316.17和39.35 mU/mg，而甜菜夜蛾體壁中海藻糖酶活性最高達(dá)139.99 mU/mg。

本研究從自然界選育獲得1株產(chǎn)海藻糖酶的細(xì)菌——大黃歐文氏菌(E.rhapontici)，該酶具有良好的催化活性和操作穩(wěn)定性。除SDS和PMSF對酶活力有抑制作用以外，其他外界環(huán)境因素對酶活性影響較小。截至目前大黃歐文氏菌(E.rhapontici)產(chǎn)海藻糖酶尚未見文獻(xiàn)報道，本研究針對該野生菌產(chǎn)海藻糖酶的特性進(jìn)行初步探究，可為后續(xù)采用基因工程進(jìn)行海藻糖酶重組表達(dá)、分子改造和規(guī)?；苽涞妊芯刻峁﹨⒖肌?/p>