外切菊粉酶的酶學(xué)研究進(jìn)展

何麗梅， 張 蕊,2,3， 李 娜， 雷 曦， 周峻沛,2,3*

(1．云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2．生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3．云南省高校高原特色食品酶重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

菊粉又稱(chēng)菊糖，其來(lái)源較為廣泛，在植物、海藻、真菌和細(xì)菌中都有分布，主要來(lái)源于植物[1]。目前已發(fā)現(xiàn)含有菊粉的植物大約有3.6萬(wàn)種，包括單子葉植物的禾本科、百合科、芭蕉科以及雙子葉植物的龍膽科、菊科、桔?？频?1個(gè)科，表1中例舉了部分常見(jiàn)植物中菊粉的含量，其中菊芋和菊苣的菊粉含量較高，占其塊莖干重的50%以上，菊芋和菊苣的抗逆性、適應(yīng)性強(qiáng)，在中國(guó)的許多地方都有種植，因此最適宜用來(lái)生產(chǎn)菊粉[2]。菊粉是果聚糖的一種，它由D-呋喃果糖經(jīng)β-2, 1-糖苷鍵毗連而成，其還原端有一個(gè)葡萄糖殘基經(jīng)α-1, 2-糖苷鍵毗連[3]。菊粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為G-1, (2-F-1) n-1,2-F，簡(jiǎn)寫(xiě)GFn，G代表終端葡萄糖單元，F(xiàn)代表果糖單元，n代表果糖的單元數(shù)，大多數(shù)的菊粉屬于此類(lèi)結(jié)構(gòu)(圖1)。菊粉是果糖基可再生資源的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，可被菊粉酶分解用于生產(chǎn)果糖、高果糖漿、燃料乙醇、菊粉寡糖等產(chǎn)品。菊粉酶(Inulinase)是一類(lèi)能夠水解β-2, 1-D果糖苷鍵的水解酶，稱(chēng)為β-2, 1-D果聚糖酶，也稱(chēng)作β-果糖苷酶、β-果聚糖水解酶，β-2, 1-D果聚糖水解酶(EC3.2.1)[4]。菊粉酶是糖苷水解酶32家族(Glycosyl hydrolases family 32)的一員。菊粉酶普遍存在于微生物和植物中，其中來(lái)源于植物的菊粉酶只催化菊粉，來(lái)源于微生物的大部分菊粉酶除能催化菊粉外還能催化含有β-2, 1-糖苷鍵的糖，如蔗糖和棉子糖等；只有少部分來(lái)源于微生物的菊粉酶僅對(duì)菊粉有催化作用。微生物菊粉酶在菊粉的應(yīng)用中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，本文主要從微生物菊粉酶方面進(jìn)行論述。

表1 常見(jiàn)植物的菊粉含量

圖1 菊粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of inulin

1 菊粉酶的分類(lèi)

根據(jù)來(lái)源不同，菊粉酶可分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶，根據(jù)菊粉酶在果聚糖鏈上催化方法的差別，菊粉酶可被分為外切型菊粉酶(EC3.2.1.80)和內(nèi)切型菊粉酶(EC3.2.1.7)[5]。外切型菊粉酶可逐一切斷果聚糖鏈非還原性末端的β-2, 1-糖苷鍵，主要產(chǎn)物為果糖；果聚糖、菊粉、蔗糖等也可作其催化底物。菊粉果聚糖鏈內(nèi)部的β-2, 1-糖苷鍵能隨機(jī)地被內(nèi)切型菊粉酶斷開(kāi)，低聚果糖(多為四糖或五糖)為主要產(chǎn)物，此外，內(nèi)切型菊粉酶還缺乏蔗糖酶活性[6]。通常認(rèn)為，I/S值是辨別轉(zhuǎn)化酶和菊粉酶以及外切酶和內(nèi)切酶的主要參數(shù)，I表示菊粉做催化底物時(shí)的酶活，S表示蔗糖做催化底物時(shí)的酶活[1]。按照菊粉酶在微生物體內(nèi)存在位置的差別可將其分為三種：位于細(xì)胞外的胞外酶，位于細(xì)胞壁的胞壁連系酶和位于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶。這三種酶的比例主要受菌種、溫度、pH、碳源的影響[7]。

2 菊粉酶的來(lái)源與性質(zhì)

植物、泥土、水、動(dòng)物消化道中的多種微生物都可以產(chǎn)生菊粉酶。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，細(xì)菌的12個(gè)屬、酵母菌的10個(gè)屬和絲狀真菌的17個(gè)屬均可產(chǎn)生菊粉酶[8]。例如，絲狀真菌中的青霉屬(Penicillium)[9]、曲霉屬(Aspergillus)[10]，酵母菌中的克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)[11]、畢赤酵母屬(Pichia)[12]，細(xì)菌中的芽胞桿菌屬(Bacillus)[13]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[14]，其中又以曲霉屬、青霉屬及克魯維酵母屬的菊粉酶研究較多。大多數(shù)微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶。外切型菊粉酶的主要酶學(xué)特性及菌株見(jiàn)表2。

表2 外切菊粉酶酶學(xué)性質(zhì)

續(xù)表2-1

續(xù)表2-2

2.1 pH

絕大多數(shù)微生物產(chǎn)生的外切菊粉酶最適pH值為4.0～6.0，多數(shù)外切菊粉酶在最適pH附近可保持相對(duì)穩(wěn)定。少數(shù)外切菊粉酶的最適pH值為中性(7.0)，如Bacilluspolymyxa[13]和Bacillussp.[34]來(lái)源的外切菊粉酶的最適pH值均為7.0；Sphingobacterium[40]來(lái)源的外切菊粉酶rInuAGN25的最適pH值為7.0，在pH值6.0～8.0的緩沖液中較穩(wěn)定，孵育1 h后，酶能保持50%以上的相對(duì)活性；Arthrobacter[39]來(lái)源的外切菊粉酶rInuAMN8的最適pH值為7.0，在pH值6.0～9.0的緩沖液中較穩(wěn)定，孵育1 h后，酶能保持60%以上的相對(duì)活性。極少數(shù)的外切菊粉酶的最適pH值偏堿性，如Actinomycete[43]來(lái)源的外切菊粉酶的最適pH值為8.0，在pH值5.0～11.0的緩沖液中較穩(wěn)定，孵育1 h后，酶能保持81%以上的相對(duì)活性。Marinimicrobium[44]來(lái)源的外切菊粉酶的最適pH值為9.0。

綜上所述，大部分外切菊粉酶的最適pH為弱酸性，其活性在酸性至微堿性條件下保持穩(wěn)定，而適應(yīng)堿性條件的外切菊粉酶的相關(guān)特性還需要進(jìn)一步研究。大部分外切菊粉酶適應(yīng)酸性環(huán)境的機(jī)理還需要通過(guò)酶的突變、晶體結(jié)構(gòu)解析等手段進(jìn)一步揭示。

2.2 溫度

曲霉屬[16,19-20,22-23]來(lái)源的外切菊粉酶的最適溫度一般在60 ℃，低于70 ℃時(shí)，酶較穩(wěn)定，半衰期較長(zhǎng)；青霉屬[25-26,45]來(lái)源的外切菊粉酶最適溫度一般為5～55 ℃，低于70 ℃時(shí)，酶較穩(wěn)定，半衰期較長(zhǎng)；其他大部分外切菊粉酶的最適溫度均在50～60 ℃之間，而最適溫度為低溫或在低溫下活性較高的外切菊粉酶報(bào)導(dǎo)較少，本實(shí)驗(yàn)室(生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心)發(fā)現(xiàn)的外切菊粉酶InuAGN25和InuAMN8就屬于低溫類(lèi)型[39-40]。由于低溫酶能在低溫條件下進(jìn)行摧氏反應(yīng)，使其在應(yīng)用上具有一定的優(yōu)勢(shì)：超過(guò)地球總面積的75%為低溫環(huán)境，適合低溫酶催化作用；在低溫條件下處理的食品可防止食品營(yíng)養(yǎng)損失和品質(zhì)下降；將中溫或者高溫處理方式轉(zhuǎn)為低溫處理(終年低溫和季節(jié)性低溫地域的天然環(huán)境下的處理)方式可降低能耗[46]。例如，外切菊粉酶將菊粉水解為果糖，做為釀酒酵母的發(fā)酵底物，有些釀酒酵母可以在20 ℃以下發(fā)酵果糖生產(chǎn)酒和生物乙醇(一般酵母的發(fā)酵溫度多在30 ℃左右)，適合利用低溫酶，同時(shí)降低了因原料高溫加熱及冷卻造成的能耗損失。

低溫酶也普遍存在一些問(wèn)題，酶的生產(chǎn)、保存等需要酶具有較好的熱穩(wěn)定性，而低溫酶熱穩(wěn)定性差，需要在保證活性的同時(shí)提高熱穩(wěn)定性；隨著溫度降低，酶的催化活性也隨之降低，在低溫條件下，低溫酶較中高溫酶的活性相對(duì)較高，但為了滿(mǎn)足應(yīng)用需求，仍然需要提高其低溫活性。因此，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)理性設(shè)計(jì)方法增加低溫外切菊粉酶InuAGN25的離子鍵，設(shè)計(jì)了8點(diǎn)突變的突變體酶Mut8S，Mut8S的最適pH值為6.5，比InuAGN25的pH值提高0.5，最適溫度為40 ℃，相較于InuAGN25降低5 ℃，50 ℃處理60 min仍有100%的酶活，表明其熱穩(wěn)定性高于InuAGN25[47]；本實(shí)驗(yàn)室還通過(guò)刪除位于InuAGN25N端的3個(gè)氨基酸(Q23、T24和G25)，得到了突變體酶MutQ23△3。突變體酶MutQ23△3的最適溫度為45 ℃，與InuAGN25相同，但MutQ23△3經(jīng)50 ℃處理60 min后，仍有100%的酶活，表明突變體酶MutQ23△3的熱穩(wěn)定性也高于InuAGN25[48]。Zhou等[3]通過(guò)融合IBM(inulin-binding module)，得到外切菊粉酶突變酶rINUIBM，該突變酶的催化效率(kcat/Km(app))顯著高于野生酶rINU，最適溫度(60 ℃)比rINU高5 ℃，pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性有所提高，其最適pH值(4.5)與rINU相同。Arjomand等[15]采用定點(diǎn)突變方法刪除6個(gè)相鄰的loop區(qū)片段，得到外切菊粉酶突變株△6SL，該突變株的熱穩(wěn)定性變差，表明該loop區(qū)片段對(duì)外切菊粉酶的熱性質(zhì)有一定的影響。Arjomand等[18]采用定點(diǎn)突變的方法突變催化域的1個(gè)組氨酸殘基，得到H192A突變株，該突變酶的熱穩(wěn)定性及催化活性均降低，表明His192對(duì)外切菊粉酶的熱性質(zhì)有一定的影響。

2.3 比活力和動(dòng)力學(xué)

不同來(lái)源的外切菊粉酶比活力和對(duì)菊粉的米氏常數(shù)差異均較大，即使是同一種屬的外切菊粉酶對(duì)菊粉的米氏常數(shù)也如此(表2)，如曲霉屬中的Aspergillusawamori和AspergillustubingensisCR16來(lái)源的外切菊粉酶的米氏常數(shù)分別為0.003和1.25 mmol/L[16,19,22-23]。

2.4 抑制劑和激活劑

金屬離子、有機(jī)試劑和表面活性劑對(duì)不同的外切菊粉酶均有不同的影響(表2)。Hg2+幾乎對(duì)所有的外切菊粉酶均具有抑制作用；Ag+抑制了大部分外切菊粉酶的活性，卻提高了Penicillium來(lái)源的2個(gè)外切菊粉酶活性[27]；EDTA對(duì)曲霉屬[22]、青霉屬[45]、鏈霉菌屬[35]、節(jié)桿菌屬[38]和克魯維酵母菌屬[31]來(lái)源的外切菊粉酶均具有抑制作用。

2.5 菊粉酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

菊粉酶是糖苷水解酶32家族(GH32)的一員，此家族有共同的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征，含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域?yàn)榇呋?，是由?折疊形成的5葉片螺旋槳結(jié)構(gòu)；C端為β-折疊形成的似三明治狀結(jié)構(gòu)(圖2)[49]。推測(cè)C端結(jié)構(gòu)對(duì)外切菊粉酶的多聚體形成、酶與底物結(jié)合等起作用。本實(shí)驗(yàn)室曾嘗試將C端去除，發(fā)現(xiàn)得到的突變體不能正常表達(dá)，也檢測(cè)不到外切菊粉酶酶活(結(jié)果未發(fā)表)，表明C端對(duì)外切菊粉酶的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了重要的影響，其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

菊粉酶的催化機(jī)制為雙替位機(jī)制。2個(gè)酸性氨基酸殘基(Glu和Asp)在該機(jī)制中起主要的催化作用[49]，在這個(gè)催化過(guò)程中，去質(zhì)子化的氨基酸Asp41首先作為親和試劑攻擊底物糖基的異頭碳，從而與糖基形成共價(jià)中間體，此時(shí)，氨基酸Glu241提供質(zhì)子進(jìn)行酸催化，從而促進(jìn)底物離去基團(tuán)發(fā)生解離，致使糖苷鍵斷裂，接著Glu241發(fā)揮堿催化作用，激活水分子為受體分子，促使共價(jià)中間體的糖基與酶解離完成水解過(guò)程。

3 菊粉酶基因的異源表達(dá)

3.1 菊粉酶基因在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是最先用于表達(dá)外源基因的表達(dá)系統(tǒng)之一，該表達(dá)系統(tǒng)的機(jī)制也研究得較為成熟。大腸埃希菌遺傳背景清晰，傳代時(shí)間短，生長(zhǎng)繁殖快，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，并能高效表達(dá)外源基因[50]。隨著大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)的成熟，在載體和菌株方面可有很多選擇[51]。此外，大腸埃希菌外源基因產(chǎn)物的表達(dá)水平較高、操作方便，較其他基因表達(dá)系統(tǒng)有一定的優(yōu)勢(shì)[52]。因此，大腸埃希菌是目前基因工程中應(yīng)用較廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)[53]。

圖2 菊粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of inulinase

來(lái)源于原核生物和真核生物的外切菊粉酶基因在大腸埃希菌中均得到成功表達(dá)。Kwon等[13]將來(lái)源于BacilluspolymyxaMGL21的外切菊粉酶基因inu在E.coli中表達(dá)，其理論蛋白分子量為55.5 kDa，Km和最大反應(yīng)速率Vmax分別為0.7 mmol/L和2 500 μmol/(min·mg)。同年，Tsujimoto等[41]將來(lái)源于GeobacillusstearothermophilusKP12899(生長(zhǎng)溫度為41～69 ℃)的外切菊粉酶基因inuA在E.coliHB101中表達(dá)，其重組酶分子量為54 kDa，且該重組酶酶學(xué)性質(zhì)與天然酶一致，首次獲得了重組酶的晶體。次年，Kim等[34]將來(lái)源于Bacillussp. snu-7的外切菊粉酶基因連接pRESET B 載體并在E.coliBL21(DE3)PLysS中過(guò)表達(dá)，其重組酶蛋白分子量為60 kDa，Km和Kcat分別為2.3 mmol/L和358.0/min。來(lái)源于真核生物的外切菊粉酶基因也能在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，Chen等[17]將來(lái)源于AspergillusficuumJNSP5-06的外切菊粉酶基因的兩個(gè)外顯子單獨(dú)擴(kuò)增，通過(guò)overlap PCR結(jié)合在一起，并在E.coli表達(dá)，重組酶分子量為63 kDa，并在大腸埃希菌細(xì)胞上清液中測(cè)得最高酶活力達(dá)59.24 U/mg。Yedahall等[21]將來(lái)源于Aspergillusniger12的外切菊粉酶基因第一次在大腸埃希菌中進(jìn)行異源表達(dá)，重組外切菊粉酶的蛋白分子量約為81 kDa，以菊粉作為底物，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax分別是5.3 mmol/L和402 μmol/(min·mg)。Arjomand等[18]將黑曲霉外切菊粉酶基因及其突變體在大腸埃希菌中克隆表達(dá)，H192A突變體最大反應(yīng)速率降低1.13倍，從野生酶的4 384.3 mol/(min·mg)降到了3 873.6 mol/(min·mg)，Km值增加1.7倍，從1.9 mmol/L增加到3.2 mmol/L，除此之外，酶的催化效率降低了約2倍。

本實(shí)驗(yàn)室將黑頸鶴糞便分離菌Sphingobacteriumsp. GN25的外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達(dá)，酶活達(dá)290.9 U/mg[40]；將來(lái)源于Sphingomonassp. JB13的外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達(dá)，其重組酶分子量為54 kDa，酶活達(dá)73.7 U/mg[37]，該研究首次報(bào)道了一種耐洗滌劑、耐鹽、耐蛋白酶的外切菊粉酶；將來(lái)源于Arthrobactersp. HJ7外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)中表達(dá)，重組酶rInuAHJ7的分子量為95.1 kDa，酶活達(dá)44.4 U/mL[38]，該研究首次報(bào)道了節(jié)桿菌來(lái)源的外切菊粉酶，該酶具有高分子量(95.1 kDa)并且在3.0%～20.0%NaCl濃度下還具有超過(guò)98%的酶活；將來(lái)源于Ar-throbactersp. MN8外切菊粉酶基因在E.coliBL21 (DE3)表達(dá)，重組酶rInuAMN8分子量為59 kDa，酶活達(dá)62.1 U/mL[39]。

3.2 菊粉酶基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)

單細(xì)胞真核生物酵母與原核生物大腸埃希菌相比，除了具有原核生物特點(diǎn)(易培養(yǎng)、繁殖快、遺傳操作簡(jiǎn)單等)外，還具有真核生物在表達(dá)時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工、修飾及合理的空間折疊等功能的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了大腸埃希菌系統(tǒng)缺乏的蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾的不足[54]。

Zhang等[55]將來(lái)源于菊芋的基因Ht1-FEHI和Ht1-FEHII分別在PichiapastorisX-33中表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，外切菊粉酶Ht1-FEH I的Km和Vmax分別為0.68和0.001 29 mg/min；Ht1-FEH II的Km和Vmax分別為0.92和0.004 8 mg/min。將Ht1-FEHI和Ht1-FEHII分別在釀酒酵母6525中進(jìn)行異源表達(dá)，酶活分別為2.44和2.98 U/mL。Wang等[25]通過(guò)RACE PCR方法從Penicilliumjanthinellumstrain B01中得到外切菊粉酶基因inuA1的全長(zhǎng)cDNA，并將inuA1亞克隆到pPICZaC 表達(dá)載體，在P.pastorisX-33中成功過(guò)表達(dá)，純化的重組酶分子量為100 kDa，在發(fā)酵液中的最高酶活達(dá)272.8 U/mL。Cao等[32]將來(lái)源于CryptococcusaureusHYA的外切菊粉酶基因亞克隆到pPICZaA表達(dá)載體并在P.pastorisX-33中表達(dá)，重組酶分子量為60 kDa，重組酶酶活為16.3 U/mL。Ma等[28]將來(lái)源于Kluyveromycescicerisporus的外切菊粉酶基因kcINU1在P.pastorisX-33中表達(dá)，重組酶分子量為90 kDa，重組酶酶活為45.2 U/mL。

王婧等[56]將來(lái)源于克魯維酵母菌的基因inuB1連接pPIC9K表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到P.pastorisGS115，獲得GS115/inuB1菊粉酶基因工程菌。GS115/inuB1經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)菊粉酶，表觀分子量為90 kDa，比酶活性為12.29 U/mg。Zhang等[29]將來(lái)源于克魯維酵母KW02的外切菊粉酶基因在P.pastorisGS115中表達(dá)，重組酶酶活為52.0 U/mL，是野生酶的12倍，重組酶分子量為85 kDa，理論分子量為62 kDa。祝林等[57]將來(lái)源于克魯維酵母菌ATCC12424的外切菊粉酶基因構(gòu)建了外切菊粉酶畢赤酵母重組菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201)，并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，表觀分子量為90 kDa，將外切菊粉酶用去糖基化酶處理后，分子量為60 kDa，菌株GS115(pHBM1200)表達(dá)的外切菊粉酶酶活最高為89.43 U/mL，菌株GS115(pHBM1201)表達(dá)的外切菊粉酶酶活最高為14.828 U/mL。熊伍平等[31]將來(lái)源于KluyveromycesmarxianusDSM 5418的外切菊粉酶基因kcINU1在P.pastorisGS115中表達(dá)，重組酶分子量為90 kDa，理論分子量60 kDa，重組酶酶活為15.27 U/mL。

Zhang等[29]在Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變株中異源表達(dá)來(lái)自季也蒙畢赤酵母中的基因INU1，在培養(yǎng)發(fā)酵72 h后，重組菌所產(chǎn)的外切菊粉酶活力達(dá)到34.2 U/mL。Wang等[59]將來(lái)源于P.guilliermondiistrain 1外切菊糖酶基因INU1轉(zhuǎn)到Saccharomycessp.W0尿嘧啶突變體，獲得菌株MguINU1-04，該菌株在72 h內(nèi)可產(chǎn)生34.8 U/ml的外切菊粉酶活性，經(jīng)過(guò)5次連續(xù)分批培養(yǎng)，該菌株能穩(wěn)定地產(chǎn)生較高的菊粉酶活性。Zhang等[60]將來(lái)源于海洋酵母屬的flavinogenieW14-3外切菊粉酶基因連接pMIRSC11載體并在Saccharomycessp.W0中重組表達(dá)，重組酵母菌W14-3-INU-112酶活為16.8 U/mL。Wang等[61]構(gòu)建了S.cerevisiae重組菌株JZH-InuMKC，共表達(dá)基因InuC和InuMK1，該重組菌培養(yǎng)72 h，胞外菊粉酶活達(dá)到14.8 U/mL。

綜上所述，酵母表達(dá)系統(tǒng)中酵母表達(dá)的外切菊粉酶基因來(lái)源于植物、酵母、霉菌，多為真核生物基因；表達(dá)宿主多為P.pastorisX-33、P.pastorisGS115和Saccharomycessp.W0尿嘧啶突變體。

4 外切菊粉酶的應(yīng)用

雖然菊粉在飲料、乳制品、保健品等方面應(yīng)用較為廣泛，但菊粉甜度低、水溶性較差[1]等問(wèn)題仍然對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成影響，利用外切菊粉酶能水解菊粉生成90%～95%[36]的果糖這一特性，將果糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和能源工業(yè)(圖3)，對(duì)菊粉進(jìn)行更深層次、高附加值的生物產(chǎn)品開(kāi)發(fā)將成為充分利用豐富的菊粉資源的新方向。

4.1 外切菊粉酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用

高果糖漿(High-fructose syrup)被廣泛用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。1970年以來(lái)，各國(guó)最初是以淀粉和菊粉為原料，利用酶水解法和酸法制備果糖。酸法生產(chǎn)果糖產(chǎn)量雖高，但色素重、附屬產(chǎn)物多，不容易分離煉制。以淀粉為原料，利用酶法生產(chǎn)果糖，至少通過(guò)α-淀粉酶的液化、糖化酶的糖化和葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)化三步反應(yīng)才能從玉米淀粉中得到42%的高果糖漿[62]，利用外切菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)果糖糖漿，只需1步酶解，果糖含量高達(dá)90%～95%，因此該方法具有轉(zhuǎn)化過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)物單一且純度高、低污染的優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)超高濃度果糖糖漿的優(yōu)良方法[62]。王建華等[63]在酶法制備高果糖的優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，15.0%的菊糖添加22 U/g的酶量，50 ℃反應(yīng)6～36 h，底物水解率約95%，其中果糖含量占水解生成物的95%以上，葡萄糖含量小于5%，不含其他糖。Singh等[64]用離子交換樹(shù)脂將來(lái)源于KluyveromycesmarxianusYS-1的外切菊粉酶進(jìn)行固定化處理，并用25 IU的固定化外切菊粉酶55 ℃條件下分別發(fā)酵Asparagusracemosus來(lái)源的菊粉和純菊粉，4 h內(nèi)分別產(chǎn)生了39.2和40.2 g/L的果糖，即分別產(chǎn)生了85.5%和92.6%的總還原糖。Singh等[27]利用來(lái)源于P.oxalicumBGPUP-4的外切菊粉酶，在4 h、125 r/min條件下，菊粉水解率可達(dá)91.1%，總還原糖釋放量達(dá)45.55 g/L，其中含有42.99 g/L的果糖和2.56 g/L的葡萄糖。

圖3 外切菊粉酶及其應(yīng)用Fig.3 Exo-inulinases and their industrial applications

4.2 外切菊粉酶在酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用

利用外切菊粉酶發(fā)酵生產(chǎn)酒精，為酒精的生產(chǎn)提供了一條新途徑。產(chǎn)菊粉酶微生物與釀酒酵母同步糖化菊粉或菊芋粗提液發(fā)酵生產(chǎn)酒精，菊芋粗提液幾乎能被完全利用，且不需要再添加其他營(yíng)養(yǎng)成分，酒精得率達(dá)96%[65]。同步糖化法比先酸解或酶解菊粉，再發(fā)酵果糖生產(chǎn)乙醇的兩步法具有更多優(yōu)勢(shì)，省去了菊粉酸解或酶解的步驟，流程簡(jiǎn)化，成本降低，同步糖化發(fā)酵法還可以減少或去除菊粉水解產(chǎn)物的積累，進(jìn)而降低產(chǎn)物對(duì)菊粉酶的抑制作用，有利于保持較高的生產(chǎn)強(qiáng)度，從而具備優(yōu)良的工業(yè)化生產(chǎn)特點(diǎn)[66]。Zhang等[58]在Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變株中異源表達(dá)來(lái)自季也蒙畢赤酵母的基因INU1，在培養(yǎng)72 h后，可直接將菊粉水解發(fā)酵生產(chǎn)酒精，發(fā)酵液與酒精的體積分?jǐn)?shù)為100∶13.7，果糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.1%。呂躍鋼等[67]將釀酒酵母與菊粉酶共同固定化，以菊芋為原料，在催化溫度30 ℃、pH值5.5、糖濃度20%、轉(zhuǎn)速為13.5 mE/min條件下，酒精發(fā)酵速率最快，發(fā)酵24 h，酒精轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.5%，酒精含量在發(fā)酵醪中達(dá)11.98%(體積分?jǐn)?shù))。Wang等[59]將外切菊糖酶基因INU1轉(zhuǎn)到Saccharomycessp. W0尿嘧啶突變體中，獲得菌株MguINU1-04并能利用30.0%菊粉進(jìn)行發(fā)酵，獲得14.7%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇，乙醇產(chǎn)率高于0.386 g/g菊粉。Wang等[61]構(gòu)建的二倍體菌株JZD-InuMKCP，其乙醇產(chǎn)量達(dá)到了理論最大值，用該菌株發(fā)酵200 g/L菊粉時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)到2.44 g/(L·h)，發(fā)酵250 g/L的耶路撒冷朝鮮薊塊莖粉時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)3.13 g/(L·h)。Zhang等[60]將重組酵母菌W14-3-INU-112以250 g/L的菊粉作為底物，發(fā)酵168 h，能產(chǎn)生12.5%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇。Yuan等[24]將來(lái)源于Candidakutaonensis的外切菊粉酶基因在S.cerevisiaeJZ1C、JZ1C-inuKM和JZ1C-inuCK中進(jìn)行表達(dá)，并在48 h內(nèi)發(fā)酵200 g/L的菊粉，分別產(chǎn)生0.34、0.34和0.38 g/g的乙醇。

4.3 外切菊粉酶的其他應(yīng)用

外切菊粉酶還可應(yīng)用到生物柴油、醫(yī)藥等行業(yè)。Shi等[6]將外切菊粉酶和內(nèi)切菊粉酶基因在Yarrowialipolytica中共表達(dá)，得到轉(zhuǎn)化株X+N8，該轉(zhuǎn)化株發(fā)酵72 h，菊粉酶酶活達(dá)到124.33 U/mL，發(fā)酵菊粉78 h，可得到41.87%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的單細(xì)胞油，細(xì)胞干重達(dá)13.63 g/L，產(chǎn)物中超過(guò)95.01%的脂肪酸為C16～C18，可以做為生物柴油的原料。Jiang等[68]通過(guò)Clostridiumtyrobutyricum異源表達(dá)外切菊粉酶基因，利用菊芋產(chǎn)氫。Petrova等[2]利用LactobacillusparacaseiDSM 23505產(chǎn)生外切菊粉酶，將136 g/L的菊苣粉(89.3%菊粉和10.7%的蔗糖、果糖和葡萄糖混合物)完全轉(zhuǎn)化為123.7 g/L的乳酸。

5 展 望

為了更好地滿(mǎn)足應(yīng)用需求，需要從新的環(huán)境中進(jìn)一步發(fā)掘新的外切菊粉酶及菌種，或?qū)F(xiàn)有外切菊粉酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化改良，得到高酶活、耐產(chǎn)物抑制、具低溫活性、熱穩(wěn)定性好、在低pH條件下具有最優(yōu)的活性和穩(wěn)定性、耐受乙醇及耐受蛋白酶的外切菊粉酶，同時(shí)得到能高效表達(dá)外切菊粉酶的菌種。需要對(duì)具有某種酶學(xué)特性(例如低溫活性)的外切菊粉酶進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析，找到影響該酶學(xué)特性的氨基酸和結(jié)構(gòu)，通過(guò)突變進(jìn)一步明確這些氨基酸和結(jié)構(gòu)的功能，進(jìn)而揭示這些酶學(xué)特性的機(jī)理，這將有利于指導(dǎo)外切菊粉酶的改良，為外切菊粉酶應(yīng)用于生產(chǎn)提供參考。