噬菌體在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究進(jìn)展

羅巧慧， 蘭翠英， 鄧?yán)^彥， 魏堂鴻， 羅何峰

（四川德康農(nóng)牧食品集團(tuán)股份有限公司，四川成都610200）

長期以來，飼用抗生素在飼料工業(yè)中的應(yīng)用取得了良好的效果，也對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。但是，因長期濫用抗生素而引起的耐藥性問題正呈逐年增長趨勢。這不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失，而且危及到了人類的健康。因此，替代抗生素的各種策略不斷被提出，抗菌肽、噬菌體、微生態(tài)制劑等都是熱門研究對象，其中有關(guān)噬菌體的研究更是受到了廣泛的關(guān)注。

噬菌體又稱細(xì)菌病毒，是一種在細(xì)菌體內(nèi)完成增殖，通過裂解細(xì)菌將自身釋放到環(huán)境中的微生物（李躍，2014）。噬菌體在1896年被發(fā)現(xiàn)并引起廣泛關(guān)注，但隨著后來抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使得噬菌體的研究處于停滯狀態(tài)。直到20世紀(jì)80年代，由于多重耐藥菌的出現(xiàn)，研究者們又開始重視噬菌體的研究。與抗生素治療相比，噬菌體治療具有代謝效率低、殺死細(xì)菌的最低劑量低、高度的特異性、高效的殺菌效果、篩選速度快等優(yōu)勢（顧敬敏，2014）。近年來，有關(guān)噬菌體的研究有了巨大的發(fā)展，國內(nèi)外對噬菌體的應(yīng)用研究范圍很廣，包括針對人類疾病的防治、動物疾病的防治、食品中病原菌的清除、農(nóng)作物的細(xì)菌感染防治、細(xì)菌生物被膜的裂解等方面。本文著重闡述了噬菌體的生物學(xué)特性，目前的噬菌體產(chǎn)品，以及其在禽類、豬、反芻動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用，以期為噬菌體在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體的生物學(xué)特性

1.1 噬菌體的結(jié)構(gòu) 噬菌體的長度變化很大，通常為24～200 nm，T4噬菌體是最大的噬菌體之一，長約200 nm，寬80～100 nm （Sharma等，2017）。噬菌體結(jié)構(gòu)比較簡單，主要由蛋白質(zhì)外殼和遺傳物質(zhì)核酸組成，而蛋白質(zhì)外殼主要包括頭部和尾部，以T4噬菌體為例，其蛋白外殼還包括頸部、尾管、尾鞘、基片、尾針、尾絲等（李振，2018；張建城，2017）。噬菌體分布廣泛，有細(xì)菌的地方都可能有相應(yīng)噬菌體的存在，地球上大約存在1031種噬菌體（Sharma 等，2017）。

1.2 噬菌體的分類 目前，國際病毒命名委員會（ICNV）將噬菌體分為15個科，而其中屬于有尾噬菌體目的噬菌體約占96%，并且根據(jù)其尾部形態(tài)結(jié)構(gòu)，又分為短尾噬菌體科（Podoviridae）、長尾噬菌體科（Siphoviridae）和肌尾噬菌體科（Myoviridae），其數(shù)量分別占有尾噬菌體總數(shù)的14%、61%和25% （李振，2018；張建城，2017）。而根據(jù)噬菌體中所含核酸的種類，又可分為單鏈RNA（ss RNA）、雙鏈 RNA（ds RNA）、單鏈 DNA（ss DNA）、雙鏈DNA（ds DNA），目前發(fā)現(xiàn)的噬菌體絕大多數(shù)屬于ds DNA（張建城，2017）。此外，根據(jù)蛋白質(zhì)外殼分類，噬菌體又可分為無尾的二十面體結(jié)構(gòu)和有尾的二十面體結(jié)構(gòu)以及線狀體（呈線狀，沒有明顯的頭部結(jié)構(gòu)，是由殼粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu)），現(xiàn)已知的噬菌體大多為有尾的二十面體結(jié)構(gòu)（許東勤，2018）。

根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可將其分為溫和噬菌體和烈性噬菌體，烈性噬菌體感染宿主后進(jìn)入裂解性周期，其尾部蛋白與細(xì)菌宿主表面的受體特異性地結(jié)合，并將其自身的遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞后，借助宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)來復(fù)制核酸、合成蛋白質(zhì)及各種所需的酶類，隨后宿主細(xì)胞在烈性噬菌體基因編碼的蛋白（如溶菌酶、穿孔素等）的作用下從內(nèi)部裂解，釋放子代噬菌體至環(huán)境中繼續(xù)侵染其他細(xì)菌（魏炳棟等，2020）。而溫和噬菌體感染宿主后進(jìn)入溶源性周期，其將遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞以后，將其整合至宿主基因組中，隨著宿主細(xì)胞的分裂而不斷遺傳下去，但當(dāng)宿主遇到惡劣環(huán)境（如電離輻射、誘變劑等）后，溶源性周期終止，進(jìn)入裂解性周期，釋放子代噬菌體裂解宿主 （魏炳棟等，2020；張建城，2017）。因此，溫和噬菌體不適合直接用于治療，因為其可能通過將一種細(xì)菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌來介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一過程可能導(dǎo)致抗生素耐藥性的發(fā)展，甚至可能通過從原細(xì)菌中獲取基因而增加宿主的毒力（Tan等，2014）。

1.3 噬菌體的增殖機制 烈性噬菌體與細(xì)菌的作用可以大致分為吸附、注入核酸、合成、組裝、釋放這五個階段。吸附是指噬菌體通過尾部的結(jié)合蛋白與細(xì)菌細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，從而使噬菌體固定在宿主表面 （李振，2018；張建城，2017）。吸附在宿主細(xì)胞后，有尾噬菌體通過尾部末端釋放的溶菌酶來破壞宿主細(xì)胞壁肽聚糖層或特定蛋白，然后其尾鞘結(jié)構(gòu)蛋白伸入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，如同注射器的注射動作，將頭部的遺傳物質(zhì)釋放到胞內(nèi)（張建城，2017）。之后，通過利用宿主菌的R NA聚合酶合成噬菌體的mR NA，翻譯合成控制宿主細(xì)胞的早期蛋白，用于合成后續(xù)噬菌體DNA復(fù)制所需的酶以及調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，隨后，以親代噬菌體核酸為模板，大量復(fù)制擴增子代噬菌體所需的核酸（張建城，2017）。在所需的各種蛋白合成后，各蛋白按照一定程序組裝成完整的子代噬菌體顆粒，在子代噬菌體達(dá)到一定數(shù)量后，噬菌體通過內(nèi)溶素、穿孔素、膜融合蛋白等裂解細(xì)菌細(xì)胞膜及肽聚糖層，在細(xì)胞內(nèi)壓的作用下細(xì)菌細(xì)胞破裂，從而釋放子代噬菌體（許東勤，2018；張建城，2017）。

2 目前主要的噬菌體產(chǎn)品

目前，國內(nèi)外關(guān)于噬菌體的產(chǎn)品主要總結(jié)見表 1（魏炳棟等，2020；Zachary 等，2018）。

表1 主要的噬菌體產(chǎn)品

3 噬菌體在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用

3.1 噬菌體在家禽上的應(yīng)用 禽類養(yǎng)殖是養(yǎng)殖業(yè)重要的組成部分，對禽類養(yǎng)殖影響較大的細(xì)菌性疾病主要為大腸桿菌病和沙門氏菌病等，感染這些疾病可引起雛雞大批死亡，成年雞產(chǎn)蛋率和生產(chǎn)性能下降等。此外，隱性感染的大腸桿菌、沙門氏菌常以蛋、肉為主要媒介，引發(fā)人類食源性疾?。ㄎ罕澋?，2020）。目前，已有不少將噬菌體應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖來防控細(xì)菌性疾病的研究。盧國民等（2017）研究顯示，在20日齡白羽肉雞飲水中分別添加109PFU/d Bp4和Bp7大腸桿菌噬菌體15 d，可使肉雞腸道中大腸桿菌和細(xì)菌總數(shù)顯著降低，但不會改變腸道菌群多樣性。張燦等（2017）對14日齡白羽肉雞分別灌服（先連續(xù)灌服5 d后間隔3 d，再次灌服5 d）109PFU/d Bp4和Bp7大腸桿菌噬菌體的試驗結(jié)果表明，灌服噬菌體能夠特異性的降低大腸菌群數(shù)量，但不影響腸道正常菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)，同時不影響肉雞的生長性能。Wang等（2013）在1日齡AA肉雞日糧中分別添加0.5 g/kg抗生素、0.25 g/kg和 0.5 g/kg噬菌體（108PFU/g），連續(xù)飼喂32 d，結(jié)果顯示，與對照組相比，0.5 g/kg噬菌體的添加顯著降低了肉雞0～14 d的料重比，且與對照組及抗生素組相比，0.5 g/kg噬菌體的添加顯著增加了糞便中乳桿菌數(shù)量；此外，抗生素和噬菌體的添加均顯著減少了糞便中大腸桿菌和沙門氏菌的含量，且對胸肌肉色和pH沒有顯著影響。劉功成（2016）對1日齡三黃雞的研究表明，飲水中添加大腸桿菌混合噬菌體（108PFU/mL）0.50 mL/只時，料肉比效果最好，且顯著好于氟苯尼考添加組；而添加0.50 mL/只單一大腸桿菌噬菌體（108PFU/mL）的成活率最好，且顯著高于氧氟沙星和氟苯尼考組。Kim等（2014）研究表明，1日齡肉仔雞日糧中添加0.5 g/kg混合噬菌體（108PFU/g）飼喂35 d后，仔雞料重比及盲腸產(chǎn)氣莢膜桿菌C的DNA復(fù)制數(shù)顯著降低。

在蛋雞上，Lim等（2011）報道，在6周齡蛋雞日糧中添加106PFU/kg噬菌體飼喂4周，顯著降低了蛋雞口服沙門氏菌攻毒后的死亡率及肝臟、脾臟和盲腸中沙門氏菌含量。Lim等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，對1日齡蛋雞用沙門氏菌攻毒后在飼料中分別添加109、107、105PFU/g噬菌體飼喂21 d后， 蛋雞腸道中沙門氏菌的定植及環(huán)境的污染水平均降低，而與未添加噬菌體組相比，107PFU/g和109PFU/g噬菌體的添加組降低量顯著。相似的，李夢哲（2014）在沙門氏菌攻毒的蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加109PFU/g噬菌體飼喂14 d后發(fā)現(xiàn)，顯著降低了蛋雞腸道中沙門氏菌含量 （降低了1個數(shù)量級）。Zhao等 （2012）在36周齡蛋雞日糧中分別添加0.020%、0.035%、0.050%的噬菌體 （108PFU/g）飼喂6周，其結(jié)果表明，0.035%和0.050%噬菌體的添加增加了蛋雞第0～3周的產(chǎn)蛋量，而第4～6周，0.020%、0.035%和0.050%噬菌體的添加均增加了產(chǎn)蛋量，減少了糞便中大腸桿菌及沙門氏菌含量，且對蛋重、蛋殼顏色、蛋殼厚度、蛋殼強度等沒有顯著影響。Adhikari等（2017）在沙門氏菌攻毒后的40周齡蛋雞上的試驗表明，日糧中分別添加0.1%和0.2%的噬菌體 （108PFU/g）飼喂兩周后，0.2%噬菌體的添加減少了攻毒7 d后蛋雞盲腸中沙門氏菌含量，且使得肝臟和脾臟中沙門氏菌含量分別降低了0.57、0.56 log cfu/g。

以上研究結(jié)果表明，肉雞及蛋雞日糧中添加或飲水中添加噬菌體（108～109PFU/g）均能降低腸道及糞便中沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等有害菌群的含量，且對肉品質(zhì)、蛋品質(zhì)及產(chǎn)蛋性能、生長性能等沒有不利影響，表明適量的噬菌體可作為抗生素替代品用于家禽生產(chǎn)中來防治細(xì)菌性疾病。但由于以上試驗中雞只品種、日齡、試驗時間及噬菌體添加方式等不同，噬菌體的添加量差異較大（0.2～2 g/kg），因此，最適添加量還需進(jìn)一步探究。

3.2 噬菌體在豬上的應(yīng)用 梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等感染往往導(dǎo)致仔豬腹瀉、成活率下降、生長受阻甚至死亡。目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體能夠有效減少試驗動物體內(nèi)的大腸埃希菌、梭狀芽孢桿菌及沙門氏菌數(shù)量，有效降低腹瀉感染率與死亡率。Hosseindoust等（2017）在仔豬日糧中添加1.0 g/kg噬菌體（109PFU/g）飼喂35 d，結(jié)果表明，噬菌體的添加增加了仔豬8～21 d平均日增重（ADG）及全期重料比（G:F），且增加了仔豬回腸乳桿菌和盲腸雙歧桿菌數(shù)，并有增加回腸雙歧桿菌的趨勢；此外，噬菌體的添加還減少了仔豬回腸和盲腸梭狀桿菌及回腸大腸桿菌數(shù)，且增加了空腸的絨毛高度。與Hosseindoust等研究相似，Kim等（2016）研究也表明，斷奶仔豬日糧中分別添加1.0 g/kg和1.5 g/kg噬菌體 （109PFU/g）連續(xù)飼喂35 d后，仔豬ADG和22～35 d總腸道干物質(zhì)表觀消化率顯著增加，同時回腸乳酸菌數(shù)及十二指腸和空腸絨毛高度顯著增加，回腸大腸桿菌及梭狀芽孢桿菌數(shù)降低。Lee等（2017）試驗發(fā)現(xiàn)，35日齡仔豬日糧中添加107PFU/kg噬菌體飼喂14 d，緩解了腸毒素原性大腸桿菌k88攻毒后仔豬ADG的降低，且顯著降低了攻毒后仔豬空腸大腸桿菌黏著評分、血清腫瘤壞死因子α（TNF-a）濃度及結(jié)腸內(nèi)容物pH，增加了回腸絨隱比。Lee等（2016）試驗表明，斷奶仔豬日糧中添加0.10%噬菌體雞尾酒（109PFU/g）飼喂35 d，提高了仔豬的ADG和G:F，且噬菌體的添加提高了總腸道干物質(zhì)表觀消化率、糞便總厭氧菌、雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)以及十二指腸和空腸的絨毛高度。Gebru等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，用鼠傷寒沙門氏菌攻毒后生長豬日糧中添加3×109PFU/kg噬菌體，增加了豬的ADFI、ADG和G:F，降低了攻毒后沙門氏菌脫落分?jǐn)?shù)。Seo等（2018）報道，28 d仔豬日糧中添加5 mL噬菌體雞尾酒（109PFU/mL）飼喂3周，可降低沙門氏菌攻毒2周后仔豬糞便中沙門氏菌脫落水平及仔豬腸桿菌菌群數(shù)，對正常糞便菌群無明顯影響。Cha等（2012）在斷奶仔豬上的研究表明，仔豬日糧中分別添加0.1%的噬菌體（106PFU/g、108PFU/g）飼喂1周后用腸毒性大腸桿菌（ETEC）攻毒3 d發(fā)現(xiàn)，噬菌體的添加使得仔豬對ETEC感染引起的腹瀉的抵抗力更強，兩組仔豬糞便中ETEC分別下降了約63.92%和60.73%。曾永娣等（2020）研究顯示，與抗生素對照組相比，斷奶仔豬日糧中添加400 mg/kg和600 mg/kg噬菌體可顯著提高仔豬全期增重及盲腸中乙酸、丁酸和總酸的含量，且仔豬腹瀉指數(shù)也顯著降低；此外，與抗生素對照組相比，400 mg/kg噬菌體的添加能夠顯著降低仔豬回腸pH，提高十二指腸黏膜蔗糖酶和乳糖酶活性及空腸黏膜麥芽糖酶活性。

在生長豬上，Saez等（2011）在生長豬日糧中添加微囊化噬菌體雞尾酒（5.0×1011PFU/d）和灌喂60 mL噬菌體雞尾酒 （5.0×1011PFU）5 d的試驗表明，噬菌體的應(yīng)用降低了豬只攻毒后2 h和4 h脫落的沙門氏菌數(shù)及回腸和盲腸中沙門氏菌含量，且日糧中添加噬菌體比灌喂更有效。Yan等（2012）研究表明，生長豬日糧中分別添加0.25、0.5 g/kg噬菌體（108PFU/g）飼喂6周后發(fā)現(xiàn)，噬菌體的添加增加了干物質(zhì)及氮消化率，降低了糞便中沙門氏菌含量，且0.5 g/kg噬菌體的添加增加了糞便中乳桿菌含量，降低了大腸桿菌含量。Kim等（2014）在生長豬日糧中分別添加1.0 g/kg噬菌體雞尾酒 （109PFU/g）、3.0 g/kg發(fā)酵益生菌、1.0 g/kg噬菌體雞尾酒+3.0 g/kg發(fā)酵益生菌進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)飼喂1.0 g/kg噬菌體及1.0 g/kg噬菌體+3.0 g/kg發(fā)酵益生菌飼糧的豬有更高的ADG、ADFI、G:F、總腸道干物質(zhì)，且粗蛋白質(zhì)以及總能的表觀消化率更高，豬糞便中總厭氧菌、雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)顯著增加，梭菌和大腸桿菌數(shù)顯著減少。同時，Kim等（2014）另一個試驗報道，生長豬日糧中分別添加0.5、1.0、1.5 g/kg 噬菌體雞尾酒（109PFU/g）飼喂 35 d后發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中噬菌體添加量的增加，ADG、ADFI和總腸道干物質(zhì)表觀消化率線性增高，同時，糞便中總厭氧菌、雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)也線性增加，而梭菌和大腸桿菌數(shù)線性減少。

以上研究結(jié)果表明，仔豬日糧中添加0.4 g/kg及以上的噬菌體，生長豬日糧中添加0.25 g/kg及以上的噬菌體（108～109PFU/g）有促進(jìn)豬只生長性能和腸道健康的作用。分析其原因為，噬菌體可能通過降低腸道中有害菌群（梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等）的數(shù)量，增加有益菌群（乳桿菌、雙歧桿菌等）的數(shù)量而促進(jìn)腸道的發(fā)育，增加了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進(jìn)而導(dǎo)致豬只的生長性能提高（Lee 等，2014）。

3.3 噬菌體在反芻動物上的應(yīng)用 在畜牧養(yǎng)殖中，大腸桿菌O157:H7在反當(dāng)動物中的流行率要顯著高于其他動物，牛已被確認(rèn)為大腸桿菌O157:H7的主要宿主和傳染源，該病菌可通過污染的牛肉及其制品或奶制品進(jìn)入食物鏈，造成人群感染（牛冬燕，2009）。 Stanford 等（2010）選用育肥肉牛飼喂1010PFU/頭/d噬菌體膠囊或在日糧中添加1011PFU/頭/d噬菌體5 d，進(jìn)行70 d的大腸桿菌檢測試驗，結(jié)果表明，飼喂噬菌體膠囊后可顯著縮短大腸桿菌O157:H7攻毒后育肥牛糞便中大腸桿菌O157:H7的脫落期，縮短了14 d。Sheng等（2006）在6月齡肉牛上的研究發(fā)現(xiàn)，用大腸桿菌 O157:H7攻毒后飲水中加 1.8×106～5.4×106PFU/mL的噬菌體或直腸給藥25 mL 1010PFU/mL 的噬菌體（0、1、2、4 d），結(jié)果顯示，直腸給藥噬菌體比飲水中添加噬菌體顯著減少了肉牛糞便中大腸桿菌O157:H7的數(shù)量。Rozema等（2009）報道，育肥肉牛口服噬菌體雞尾酒（3.3×1011PFU/頭/d）、直腸給藥噬菌體雞尾酒（1.5×1011PFU/頭/d）及口服+直腸給藥噬菌體雞尾酒（4.8×1011PFU/頭/d）的試驗表明，口服噬菌體雞尾酒可降低肉牛大腸桿菌O157:H7攻毒后糞便中大腸桿菌O157:H7的陽性率，而與口服組及口服+直腸給藥組相比，直腸給藥噬菌體雞尾酒可增加糞便中噬菌體的平均脫落水平。Bicalho等（2012）試驗顯示，給犢?？诜? mL 106PFU噬菌體雞尾酒22 d，可減少犢牛糞便中的大腸桿菌含量，且在整個試驗期沒有觀察到口服噬菌體對犢牛健康的副作用。而Raya等（2011）在綿羊上的試驗表明，口服噬菌體雞尾酒（1011PFU/mL）1周可顯著降低綿羊小腸中大腸桿菌O157:H7的含量，減少量大于99.9%。

金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌，可造成乳腺組織結(jié)構(gòu)破壞，牛奶品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響牛奶產(chǎn)量和奶牛健康。李隴平（2011）研究報道，用105PFU/mL噬菌體給泌乳期荷斯坦奶牛在擠奶前后進(jìn)行乳頭藥浴2個月后，與洗必太類乳頭藥浴液相比，噬菌體的使用使得牛乳區(qū)發(fā)病率和頭發(fā)病率分別減少了1.97%和3.33%。Gill等（2006）發(fā)現(xiàn)，給患有乳腺炎的奶牛連續(xù)注射5 d 1.25×1011PFU/mL 的噬菌體（10 mL）后，奶牛乳腺炎治愈率提高了16.7%。

以上研究結(jié)果表明，噬菌體可作為抗生素替代品來防治奶牛乳腺炎，且可以降低肉牛及綿羊腸道中大腸桿菌的含量，但由于試驗動物品種、日齡、試驗期、給藥方式等的不同，其在反芻動物上的最適給藥量及給藥方式等方面的研究還需加深。

4 總結(jié)

噬菌體應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中對其生長發(fā)育無不利影響，且可以防控畜禽細(xì)菌性疾病，緩解耐藥性的產(chǎn)生。雖然目前噬菌體應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但已有的研究表明了其在養(yǎng)殖應(yīng)用中的優(yōu)勢性。因此，擴大噬菌體的宿主譜、安全高效地給藥方式、最佳劑量等方面的問題都是今后噬菌體應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中的研究重點。此外，噬菌體的作用機制、噬菌體在動物消化道中的抗菌活性、動物機體自身免疫對噬菌體的影響等方面的研究都需進(jìn)一步深入。