IFN-γ在多囊卵巢綜合征中的表達及對卵巢顆粒細胞的影響

張麗娜，王娟，姚雪，李春梅，史兵偉，夏圣

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇 常州 213003)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種常見的內分泌激素紊亂性疾病，多發(fā)于育齡期女性。臨床上PCOS患者主要以高雄性激素、肥胖、多毛、不孕為主要特點，同時患者常伴有月經(jīng)紊亂、卵巢功能失衡。卵巢顆粒細胞與卵母細胞關系十分密切,可供給卵母細胞生長發(fā)育所需的85%的營養(yǎng)[1]，影響著卵泡的啟動、發(fā)育、成熟及閉鎖。有研究表明，高雄激素可抑制顆粒細胞的增殖及卵母細胞的成熟[2]。Nehir等[3]發(fā)現(xiàn)炎癥因子與PCOS患者的高雄激素血癥密切相關。研究表明，PCOS患者體內有部分炎癥因子表達水平明顯上調[4-6]。但是，炎性因子對顆粒細胞產(chǎn)生的影響及在PCOS發(fā)病中的作用還不明確。本研究擬檢測PCOS患者外周血中炎癥因子IFN-γ的表達水平，并探討IFN-γ對卵巢顆粒細胞增殖、凋亡的影響，以期探究IFN-γ在PCOS疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本采集 收集31例2016年11月至2017年6月在常州市中醫(yī)醫(yī)院初診、年齡為21～34歲的PCOS患者和22例年齡匹配的健康志愿者血液標本。所有PCOS患者的診斷都符合鹿特丹診斷標準[7]：① 低排卵/無排卵；② 臨床癥狀和(或)生化檢查表現(xiàn)為高雄激素血癥；③ 超聲顯示多囊卵巢的存在，符合3 項中的2項，并排除如先天性腎上腺增生、非經(jīng)典腎上腺增生、庫欣綜合征、分泌雄激素腫瘤、特發(fā)性雄激素過多癥、特發(fā)性多毛癥，高催乳素血癥和甲狀腺疾病等其他疾病。健康志愿者符合以下條件：① 有規(guī)律的月經(jīng)周期；② 性激素水平正常；③ 無代謝性或炎癥性疾病。所有受試者均未接受治療。本研究獲常州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會通過，患者及家屬均知情并簽署知情同意書。

1.1.2 實驗細胞及試劑 人卵巢顆粒細胞瘤KGN細胞(上海江林生物科技有限公司)；人IFN-γ(上海達科為生物技術有限公司)；細胞刺激劑試劑盒(Leuko Act Cktl with GolgiPlug)、抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5、抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC、人Th1/Th2細胞因子試劑盒(美國BD公司)；Fix &Perm破膜劑(美國Nordicmubio公司)；細胞周期試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)；APC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)細胞增殖試劑盒(美國Thermo公司)；RPMI-1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco 公司)；青鏈霉素混合液(美國Sigma公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

KGN細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素混合液)的DMEM/F12培養(yǎng)液中，細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.3 外周血單個核細胞(PBMC)的分離制備

PCOS患者和對照組肝素抗凝肘靜脈血，3 500 r/min常溫離心5 min，收取血漿并于-80 ℃保存。余下細胞加入等體積的PBS稀釋，輕輕顛倒混勻后，輕柔逐滴滴入到預先加入的等體積Ficoll淋巴細胞分離液液面上，2 000 r/min常溫離心20 min。吸取PBMC所在細胞層的細胞，轉入新離心管中，加入PBS，2 000 r/min離心10 min洗滌。共洗滌3次，去上清液后，將細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，用于后續(xù)實驗。

1.4 流式細胞儀分析Th1、Th2細胞

將細胞計數(shù)后，接種于24孔板內，每孔加細胞刺激劑，給予5 h刺激后，收集細胞；PBS清洗后依次加入抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5抗體，染色30 min；PBS清洗后，加破膜劑試劑A，室溫靜置15 min；PBS清洗后，加入破膜劑試劑B和抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC抗體，染色45 min；PBS清洗后加入200 μL PBS，上流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)檢測。用CD3+、CD8-抗體反圈門，CD3+CD8-IFN-γ+的細胞為Th1細胞，CD3+CD8-IL-4+的細胞為Th2細胞。設置同型對照用于消除抗體與細胞非特異性結合所產(chǎn)生的背景染色。數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進行分析。

1.5 血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ的表達水平流式細胞儀CBA法檢測

血漿中細胞因子的檢測采用流式細胞小球微陣列術(cytometric bead array,CBA)法。首先制備混合微球液，流式EP管中依次加入50 μL預處理好的混合微球液、50 μL的樣本和各濃度標準品、50 μL的藻紅蛋白熒光抗體，充分混勻，室溫避光孵育3 h。每管加1 mL 緩沖液，1 800 r/min離心5 min；棄上清液，最后加入120 μL 緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。標準曲線用FACS Array3.0分析軟件繪制，根據(jù)標準曲線計算出血漿中各種細胞因子的濃度。

1.6 CFSE標記法檢測KGN細胞增殖

培養(yǎng)KGN細胞，待細胞處于對數(shù)生長期時用胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS調整細胞懸液濃度至2×106/mL。將調整好細胞密度的單細胞懸液與等體積CFSE工作液混合，使CFSE的終濃度為 2.5 μmoL/L，充分混勻后，避光、室溫靜置10 min。加入含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液終止反應，1000 r/min離心5min，棄上清液；加入PBS 1000r/min離心5 min，棄上清液，共洗滌細胞2次。將CFSE標記的KGN細胞懸液以每孔6×104個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)1～2 d后，待細胞生長至合適密度時，將KGN細胞分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集兩組細胞。分別加入2 μL 7-AAD染色液，流式細胞儀檢測7-AAD陰性的KGN細胞增殖情況。重復實驗3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

培養(yǎng)KGN細胞，待細胞處于對數(shù)生長期時消化收集細胞，每孔以5×104個細胞接種于6孔板內預培養(yǎng)1～2 d。將KGN細胞分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集兩組細胞并用PBS洗滌2遍。分別加入2 mL 70%冷乙醇固定細胞，輕輕混勻，4 ℃過夜。1 500 r/min離心5 min，去除固定液，加預冷的PBS洗滌細胞，洗滌2～3次。依次加入100 μL細胞周期試劑A、100 μL試劑B和150 μL試劑C，輕柔混勻，室溫放置15 min。檢測前用300目尼龍篩網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測。重復實驗3次。

1.8 流式細胞術檢測IFN-γ誘導的細胞凋亡

培養(yǎng)KGN細胞，待細胞處于對數(shù)生長期時，消化收集細胞以每孔6×104個細胞培養(yǎng)于6孔板內，將KGN細胞分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，分別在0、24、48、72 h顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，確定流式檢測細胞凋亡的最適時間。收集對照組與干擾素處理組處理48 h后的細胞，并用PBS洗滌2遍，加250 μL 結合緩沖液重懸細胞使其終濃度為1×106/mL。取100 μL細胞懸液，加入2.5 μL Annexin V/Alexa Fluor 647、5 μL 20 μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻、避光孵育15 min，加400 μL PBS上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PCOS患者的超聲診斷特征

超聲可見PCOS患者至少一側卵巢存在≥12個直徑為2～9 mm的小卵泡，和(或) 卵巢體積>10 cm3。見圖1。

圖1 健康志愿者和PCOS患者卵巢超聲影像

2.2 流式細胞儀檢測PBMC中Th1、Th2細胞比例

與對照組相比，PCOS患者血漿中Th1比例明顯上調，Th2細胞的比例差異不明顯(圖2A、2B)。結果顯示，PCOS患者血漿中Th1的比例較對照組明顯升高(t=9.506，P<0.01)；而Th2細胞在兩組中的比例無明顯差異(圖2C、2D)。

A：Th1細胞流式分析；B：Th2細胞流式分析；C：PBMC中Th1細胞結果分析；D：PBMC中Th2細胞結果分析圖2 流式細胞儀檢測PCOS患者外周血中Th1、Th2細胞比例

2.3 血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ的流式細胞儀定量檢測

結果顯示，兩組IL-4比較差異無統(tǒng)計學意義，PCOS組IL-6和IFN-γ水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.029，P<0.01；t=-2.306，P<0.05)。見圖3。

圖3 流式細胞儀CBA法檢測PCOS患者血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ水平

2.4 IFN-γ對KGN細胞增殖的影響

流式分析時，先對KGN細胞設門分析，去除樣本中的細胞碎片；再對7-AAD陰性細胞設門，以排除死細胞的影響，繼而分析KGN細胞CFSE的熒光強度。結果顯示，干擾素處理組KGN細胞的增殖較對照組右移，表明KGN細胞在加入干擾素處理后可抑制KGN細胞的增殖。見圖4。

圖4 KGN細胞增殖的CFSE流式細胞儀檢測

2.5 IFN-γ對KGN細胞周期影響

流式分析時，先對KGN細胞設門，去除細胞碎片；再對細胞周期分析的單細胞群體設門，去除黏連細胞，繼而分析單細胞中處于各細胞周期的細胞比例。結果顯示，與對照組相比，干擾素處理的KGN細胞中處于G0-G1期細胞比例增加，S期和G2-M期細胞比例均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。表明KGN細胞在加入干擾素處理后，細胞周期被阻滯在G0-G1階段。見圖5。

圖5 IFN-γ對KGN細胞周期影響

2.6 IFN-γ對KGN細胞凋亡的影響

使用250 ng/mL IFN-γ對KGN細胞處理24 h后，干擾素處理組與對照組比較無明顯差異；處理48 h后，與對照組相比，干擾素處理組細胞增殖的速度和密度降低；處理72 h后，干擾素處理組細胞密度明顯降低，細胞發(fā)生退化現(xiàn)象。收集培養(yǎng)48 h細胞檢測細胞凋亡水平，流式分析結果顯示，處理48 h后，干擾素處理組早期凋亡比例與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干擾素處理組晚期凋亡比例與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=-11.667，P<0.01)。見圖6。

A：IFN-γ刺激KGN細胞不同時間后的細胞形態(tài)觀察(×40)；B：IFN-γ刺激KGN細胞48 h細胞凋亡圖6 IFN-γ對KGN細胞凋亡的影響

3 討論

PCOS是一種育齡期女性的內分泌紊亂性疾病，影響著5%～10%的女性身體健康，給處于生育期的婦女帶來了極大的困擾[8]。研究表明，PCOS患者IL-6、PAI-1、CRP、TNF-α等炎癥因子表達水平升高[9-10]；Qin等[11]發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液中IFN-γ、IL-2細胞因子水平明顯上調。本研究通過流式細胞儀檢測PCOS患者和健康對照組外周血中Th1、Th2型細胞的比例，結果顯示，與對照組相比，PCOS患者外周血中IFN-γ+Th1型細胞比例明顯上調，IL-4+Th2型細胞比例則無明顯差異。Gong等[12]在研究PCOS婦女Th1/Th2免疫失衡與肥胖的關系時發(fā)現(xiàn)，PCOS患者體重指數(shù)和腰圍升高時，Th1/Th2比值升高，PCOS患者全身免疫向Th1免疫轉移。Nasri等[13]研究不育PCOS患者體內Th細胞之間的平衡關系時發(fā)現(xiàn)，Th細胞免疫平衡的改變可能導致不孕。復發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇等妊娠并發(fā)癥患者Th1升高、Th2應答降低[14-15]。

本研究結果顯示，PCOS患者血漿中IFN-γ水平升高，與最近有學者發(fā)現(xiàn)的PCOS患者血清中IFN-γ水平低于對照組的結果存在偏差，可能是由于不同研究所選患者的疾病進程及患者入組時的條件差異所致。Xie等[17]通過PCOS鼠模型發(fā)現(xiàn)，PCOS小鼠脾臟IFN-γ+Th細胞比例以及IFN-γ+CD19+B細胞比例增加，子宮及卵巢組織中IFN-γ的表達水平升高，本研究結果與其一致。PCOS患者常見的臨床特征有胰島素抵抗、高雄激素血癥及卵巢功能紊亂等，炎癥因子介導的信號通路轉導可通過阻滯胰島素受體酪氨酸激酶活性，誘導胰島素抵抗的形成，繼而干擾肝臟性激素結合球蛋白合成，間接引起高雄激素血癥[18-19]。也有研究表明，炎癥細胞因子水平與PCOS患者體內下丘腦-垂體-性腺軸平衡密切相關，可通過影響性激素分泌，阻滯卵泡發(fā)育和排卵[20]。

Th1細胞是CD4+T細胞的一個亞群，活化后可分泌包括IFN-γ在內的多種促炎因子，在自身免疫性內分泌疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α能抑制人顆粒細胞增殖，誘發(fā)顆粒細胞凋亡[22]。本研究結果表明，IFN-γ不但抑制KGN細胞增殖，也可誘導KGN細胞凋亡。在整個卵母細胞發(fā)育過程中，圍繞卵母細胞的顆粒細胞主要提供卵母細胞營養(yǎng)物質及生長調節(jié)劑[23]。若顆粒細胞發(fā)生凋亡，可能會導致卵母細胞核成熟延遲[24]。PCOS患者因“促卵泡刺激素-顆粒細胞軸”功能低下、顆粒細胞凋亡、芳香化酶功能低下不能將卵泡內膜細胞合成的雄激素轉化成雌二醇,從而引起體內雄激素積累過多、卵泡發(fā)育中途停滯，最終導致優(yōu)勢卵泡選擇發(fā)生障礙。PCOS患者體內有較多直徑為2～9 mm的竇卵泡停止生長，使卵巢形成多囊狀改變。

綜上所述，PCOS患者體內IFN-γ水平上調，IFN-γ可抑制KGN細胞增殖并促進KGN細胞凋亡。因此，T細胞介導的活化及其分泌的IFN-γ可能在PCOS發(fā)病中起一定作用，為PCOS的診斷與治療提供了理論依據(jù)。