白芥子貼膏穴位貼敷對過敏性鼻炎大鼠的免疫調(diào)制作用研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜慢性炎性疾病，臨床表現(xiàn)主要以鼻塞、流涕、噴嚏為主，較重者可并發(fā)多種其他疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前廣泛使用的西藥丙酸氟替卡松鼻腔噴霧劑只能短暫地緩解癥狀，遠(yuǎn)期效果不甚理想。多種研究顯示，輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）和輔助性T細(xì)胞2（helper T cell 2，Th2）的免疫失衡與AR的發(fā)生與發(fā)展過程密切相關(guān)[2-3]。穴位貼敷作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)外治療法，可以通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，從而改善機(jī)體免疫狀態(tài)，臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)其對AR的防治效果[4]。臨床研究報(bào)道，生/炒白芥子貼膏穴位貼敷均可有效治療呼吸道過敏性疾病，但兩者的療效差異存在爭議[5-6]。故本研究通過建立AR大鼠模型，采用行為學(xué)評估大鼠AR嚴(yán)重程度，并用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和甲苯胺藍(lán)染色法檢測生/炒白芥子穴位貼敷對大鼠血清炎癥因子水平和鼻黏膜中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響，對比生/炒白芥子貼膏穴位貼敷治療AR的療效差異，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取無特定病原體（specific pathogen free，SPF） 級健康雄性Wistar大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量250～300g，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫21～25℃、濕度60%～70%的環(huán)境中，自由飲水并以普通飼料飼養(yǎng)，12h晝夜交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究方案通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)，研究過程嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施:GB14925-2001》[7]，遵循倫理原則并保障動(dòng)物福利。

1.2 主要試劑及儀器 生白芥子貼敷膏藥（生白芥子、細(xì)辛、甘遂、延胡索）和炒白芥子貼敷膏藥（炒白芥子、細(xì)辛、甘遂、延胡索）均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院配制；丙酸氟替卡松鼻腔噴霧劑（每噴含丙酸氟替卡松50μg，濃度0.05%）購于Glaxo Smith Kline公司（批號：H20091100）；雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）購于Sigma公司 （批號：A5503）； 白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ （interferon-γ，IFN-γ）ELISA檢測試劑盒均購于美國R&D公司（批號：24924、24956、24972、24475）。Eclipse 80i型光學(xué)顯微鏡購于日本 Nikon公司；RM 2235石蠟切片機(jī)為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 AR模型制備 將50只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，對照組、模型組、西藥組、生白芥子組和炒白芥子組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠分別從第1天開始腹腔注射新鮮配制的含OVA 0.3mg和Al（OH）330mg的0.9%氯化鈉溶液1mL致敏，隔日1次，連續(xù)注射7次；第15天開始以0.9%氯化鈉溶液配制的5%OVA溶液滴鼻，每側(cè)50μg，并以1%OVA溶液霧化10min，連續(xù)滴鼻和霧化7d。對照組予以等量的0.9%氯化鈉溶液滴鼻和霧化。

1.3.2 干預(yù)方法 造模后進(jìn)行分組治療，對照組正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何干預(yù)；模型組以0.9%氯化鈉溶液滴鼻，每側(cè)5μL，隔日1次，共治療7次；生白芥子組和炒白芥子組大鼠背部剃毛，參考李忠仁[8]主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，分別在其雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞處貼敷0.5cm×0.5cm的生白芥子和炒白芥子貼敷膏，以膠布固定，2h后取下，隔日1次，共治療7次；西藥組以丙酸氟替卡松鼻腔噴霧劑噴鼻，每側(cè)5μL，隔日1次，共治療7次。

1.3.3 檢測指標(biāo)

1.3.3.1 行為學(xué)表現(xiàn) 末次滴鼻霧化致敏后和治療后即刻觀察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及毛發(fā)光澤情況，共觀察30min。將3個(gè)癥狀的分?jǐn)?shù)相加即為總癥狀評分，總癥狀評分≥5分為造模成功[9]。見表1。

1.3.3.2 血清細(xì)胞因子檢測 治療結(jié)束24h內(nèi)，各組大鼠以1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，心臟取血5mL，靜置2h后3 000r/min離心10min，取血清置于-70℃冰箱保存。ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平，操作步驟嚴(yán)格遵循ELISA試劑盒說明書，并分析幾個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性。

表1 AR癥狀評分表（分）Tab.1 Symptoms scale of AR（scores）

1.3.3.3 鼻黏膜病理觀察 各組大鼠心臟取血后，以脫頸法處死，斷頭后剪去下頜，從鼻正中開裂鼻腔，分離含有鼻黏膜的鼻中隔，以4℃的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行漂洗，10%中性甲醛溶液固定24h，石蠟包埋并切片，每一標(biāo)本隨機(jī)選取5張切片行甲苯胺藍(lán)染色，每張切片觀察5個(gè)高倍視野，觀察鼻黏膜組織肥大細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法；各組治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)法。計(jì)量資料相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后行為學(xué)表現(xiàn)比較 末次滴鼻霧化致敏后，各造模組大鼠總癥狀評分均較對照組顯著增加（P＜0.05），且均大于5分，說明AR模型造模成功。各造模組治療前組間比較，總癥狀評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。

除對照組外，其余各組大鼠治療后癥狀評分均較治療前顯著下降（P＜0.05）。與對照組比較，模型組大鼠治療后評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組治療后評分均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，生白芥子組治療后評分顯著降低（P＜0.05），炒白芥子組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。說明西藥和生/炒白芥子貼膏穴位貼敷療法均能有效控制AR癥狀，且生白芥子組療效更加顯著。

2.2 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較，治療后模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，治療后西藥組、生白芥子組、炒白芥子組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。與西藥組比較，治療后生白芥子組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著下降，IFN-γ水平顯著上升（P＜0.05）；炒白芥子組IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。提示西藥和生/炒白芥子貼膏穴位貼敷療法均能有效降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高IFN-γ水平，其中生白芥子組作用更顯著。

表2 各組大鼠AR總癥狀評分比較（±s，分）Tab.2 Comparison of AR total symptom scores in each group（±s，scores）

表2 各組大鼠AR總癥狀評分比較（±s，分）Tab.2 Comparison of AR total symptom scores in each group（±s，scores）

注：與同組治療前比較，△P＜0.05；與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05Note:Compared with before treatment of the same group，△P＜0.05;compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with western medicine group，▲P＜0.05

治療后對照組 2.00±0.89 1.50±0.50模型組 6.00±0.50* 5.13±0.60*△西藥組 5.88±0.60* 3.75±0.43#△生白芥子組炒白芥子組組別治療前6.00±1.00*6.00±0.87*2.63±0.48#△▲3.25±0.83#△

表3 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels in each group（±s，pg·mL-1）

表3 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels in each group（±s，pg·mL-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with western medicine group,▲P＜0.05

組別 IL-1β IL-6 TNF-α IFN-γ對照組 77.18±2.67 126.81±8.43 14.90±1.19 76.02±7.51模型組 125.01±7.99* 239.48±8.99* 28.44±5.00* 30.31±7.86*西藥組 95.39±3.02# 206.00±5.83# 22.31±3.37# 55.14±5.65#生白芥子組 85.51±3.36#▲ 155.26±9.72#▲ 16.82±1.05#▲ 68.31±5.52#▲炒白芥子組 93.77±5.77# 201.70±8.67# 21.93±5.58# 56.44±5.82#

2.3 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平之間的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析提示，大鼠血清IL-1β和IL-6、TNF-α的水平呈正相關(guān)（r=0.841、r=0.595，均P＜0.05），和IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.818，P＜0.05）；IL-6和TNF-α的水平呈正相關(guān)（r=0.69，P＜0.05），和IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān) （r=-0.861，P＜0.05）；TNF-α和IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.68，P＜0.05）。見圖1。

2.4 各組大鼠鼻黏膜肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 治療后，模型組大鼠鼻黏膜肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)較對照組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、生白芥子組及炒白芥子組肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低（P＜0.05），與西藥組比較，生白芥子組肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低（P＜0.05），炒白芥子組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、圖2。

3 討論

AR為世界范圍內(nèi)的主要慢性疾病之一，調(diào)查顯示全球約20%～30%的人患有AR[10]，歐洲AR患病率為25%[11]，在美國約有3 590萬人患有AR[12]，我國西部地區(qū)患病率34.41%，北方地區(qū)平均患病率9.3%，并呈逐年顯著增加的趨勢[13]。

圖1 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ之間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between rat serum IL-1β，IL-6，TNF-α and IFN-γ

表4 各組大鼠鼻黏膜肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s，個(gè)）Tab.4 Comparison of mast cell count in nasal mucosa in each group（±s，count）

表4 各組大鼠鼻黏膜肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s，個(gè)）Tab.4 Comparison of mast cell count in nasal mucosa in each group（±s，count）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with western medicine group，▲P＜0.05

肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)對照組 1.2±0.4模型組 13.6±1.02*西藥組 5.4±1.36#生白芥子組 2.6±0.49#▲炒白芥子組 5.8±0.75#組別

圖2 各組大鼠鼻黏膜中肥大細(xì)胞浸潤情況（甲苯胺藍(lán)染色，400×）Fig 2 Mast cell infiltration in the nasal mucosa of rats in each group（Toluidine blue staining,400×）

AR在中醫(yī)學(xué)中屬于“鼻鼽”范疇，病因多為肺、脾、腎三臟功能失調(diào)，復(fù)感風(fēng)寒邪氣，寒邪束于皮毛，陽氣無從泄越，故噴而上出為嚏所致，多為本虛標(biāo)實(shí)之證，以肺、脾、腎三臟氣虛陽衰為本，外感風(fēng)寒之邪為標(biāo)。清代醫(yī)家張璐[14]所著的《張氏醫(yī)通》中最早記載了用生白芥子、延胡索、細(xì)辛、甘遂和姜汁制成的貼膏穴位貼敷，用于治療呼吸系統(tǒng)疾病。穴位貼敷的作用體現(xiàn)在對穴位的刺激和藥物有效成分經(jīng)皮吸收兩方面，經(jīng)絡(luò)腧穴受到貼敷藥物的刺激后血管緊張度下降，局部溫度升高，促進(jìn)血液循環(huán)，有利于中藥成分的滲透和吸收；而局部貼敷能夠使藥物通過穴位局部皮膚細(xì)胞間隙直接吸收，兩者共同作用，有助于增強(qiáng)療效，并具有“簡便廉驗(yàn)”的特點(diǎn)[15]。因肺氣通于鼻，鼻居于面部中央，屬土屬脾，且脾為肺之母、腎為肺之根，故本研究選取肺俞、脾俞、腎俞三對穴位進(jìn)行貼敷，有效防治AR。

研究表明，AR的發(fā)生是多種炎癥細(xì)胞、介質(zhì)共同參與并相互作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制主要是體質(zhì)、環(huán)境等因素導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫紊亂，致使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化增多，從而使Th1/Th2比例失衡，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞增加，以及Th2細(xì)胞過度表達(dá)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[2-3]。IL-1β和TNF-α作為促炎細(xì)胞因子，可刺激并激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)[16-17]。IL-6作為Th2細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和活化，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放；同時(shí)它作為次級因子，可由TNF-α產(chǎn)生，并反饋性增強(qiáng)TNF-α的致炎作用[18-20]。這些因子相互作用、互相促進(jìn)，破壞了Th1/Th2的平衡，從而造成機(jī)體持續(xù)的炎性損傷[21]。而IFN-γ作為Th1細(xì)胞分泌的主要因子，具有抗病毒活性及較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，能緩解IL-1β、IL-6、TNF-α造成的Th1/Th2的失衡，從而抑制AR的進(jìn)程[22]。本研究顯示，生/炒白芥子貼膏穴位貼敷治療后大鼠噴嚏、流涕、抓鼻等AR行為學(xué)表現(xiàn)均較治療前減少，明確了穴位貼敷治療AR的有效性，其中的機(jī)制可能與降低AR大鼠血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高抗炎細(xì)胞因子IFN-γ水平，并降低鼻黏膜中肥大細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。

對于生/炒白芥子貼膏對于呼吸道過敏性疾病的療效是否有差異，臨床上尚存在一定的爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，單純生白芥子組方貼膏對于肺氣虛寒型AR的臨床療效優(yōu)于單純炒白芥子組方貼膏[23]，單純生白芥子組方貼膏組支氣管哮喘患者遠(yuǎn)期療效優(yōu)于生炒各半并用組方貼膏組及單純炒白芥子組方貼膏組[24]。生/炒白芥子不同配比的貼膏療效也有差異，生/炒白芥子1∶2配比的三伏灸協(xié)定方較生/炒白芥子1∶1配比的協(xié)定方及單純炒白芥子的協(xié)定方更能改善支氣管哮喘患者相關(guān)癥狀，并且患者皮膚反應(yīng)較輕，依從性更好[25]。也有研究顯示，由生白芥子貼膏、生/炒各半貼膏和炒白芥子貼膏治療支氣管哮喘的療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5，26]。本研究選取生/炒白芥子貼膏貼敷于AR大鼠背部相關(guān)穴位，比較兩組的療效，并試圖從免疫學(xué)角度解釋相關(guān)機(jī)制，結(jié)果顯示生白芥子組大鼠鼻部炎性癥狀改善優(yōu)于炒白芥子組、鼻黏膜病理切片中炎性改變顯著減輕，而且血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高。

綜上所述，生/炒白芥子貼膏穴位貼敷療法均能有效治療AR，而生白芥子貼膏療效更為顯著，其機(jī)制可能是生白芥子貼膏能夠更明顯地減輕大鼠鼻黏膜局部炎癥，抑制全身促炎細(xì)胞因子的釋放。本研究結(jié)果進(jìn)一步探索了穴位貼敷療法防治AR的機(jī)制，同時(shí)也為中醫(yī)藥防治AR提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。