HPLC-AFS測(cè)定雞肝中的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的不確定度評(píng)估

劉國(guó)紅，崔穎，*，趙良娟，周磊

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461；2.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

在報(bào)告測(cè)量結(jié)果時(shí)不僅要給出測(cè)定的量值是多少，還應(yīng)給出以數(shù)量表示的該值分散程度是多少[1]。它是測(cè)量質(zhì)量的指標(biāo)，用于判斷該測(cè)定值的可靠程度。測(cè)量不確定度是“表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)”。本研究根據(jù)CNAS-CL07：2011《測(cè)量不確定度的要求》、JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的規(guī)定和JJG 169-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，采用了于2020年7月1日實(shí)施的SN/T 2316-2019《出口動(dòng)物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷殘留量的檢測(cè)方法》[2-4]中新增的檢驗(yàn)方法，采用微波消解-液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷殘留量，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)能力與條件，進(jìn)行測(cè)量不確定度分析與評(píng)定，為今后評(píng)價(jià)阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

雞肝：市售。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜級(jí)）：德國(guó)Merck公司；鹽酸、硼氫化鉀、磷酸二氫鉀、過(guò)硫酸鉀（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）：北京化工廠(chǎng)；三氟乙酸（優(yōu)級(jí)純）：上海天蓮精細(xì)化工有限公司。

1.1.3 儀器

LC-AFS9750型液相色譜-原子熒光光譜儀：北京海光公司；Multiwave PRO型微波消解系統(tǒng)：奧地利Anton Paar公司；T18組織勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司；Alpha 1-4/LD-plus型凍干機(jī)：德國(guó)Christ公司；Milli-Q Reference型超純水儀：德國(guó)Millipore公司；VORTEX型渦輪混合器：美國(guó)Scientific Industries公司；3-30K型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)SIGMA公司；N-EVAP-24型水浴氮吹儀：美國(guó)Organomation Associates Inc公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱(chēng)取試樣2 g（精確至0.001 g）于微波輔助萃取罐中，加入25 mL甲醇溶液（1∶1，體積比），按照微波輔助萃取儀的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行提取。提取完畢，取出冷卻至25℃，10 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液，氮?dú)獯祾?，用甲醇溶液?∶1，體積比）定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。按同一操作方法作空白試驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用去離子水稀釋成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 樣品測(cè)定

設(shè)定好儀器測(cè)量最佳條件，根據(jù)所用儀器的型號(hào)和工作站設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，點(diǎn)火及對(duì)儀器進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱30 min后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及試樣溶液的測(cè)定。

1.3 測(cè)量模型的構(gòu)建

1.3.1 被測(cè)物含量的測(cè)量模型

計(jì)算試樣中阿散酸（或硝苯砷酸或洛克沙砷）殘留量的公式如下：

式中：Xi為試樣中被測(cè)物的殘留量，mg/kg；c1為樣液中被測(cè)物的濃度，μg/L；c0為空白液中被測(cè)物的濃度，μg/L；V為樣液體積，mL；V1為吸取上清液體積，mL；V2為最終定容體積，mL；m為最終樣液所代表的試樣量，g。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的測(cè)量模型

以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到公式如下：

式中：y為色譜峰面積；c為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物的濃度，μg/L；a為斜率；b為截距。

不確定度來(lái)源見(jiàn)圖1。

圖1 不確定度來(lái)源的因果關(guān)系圖Fig.1 Causal relationship of the sources of uncertainty

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣質(zhì)量m的不確定度評(píng)定

評(píng)估不確定度時(shí)，應(yīng)集中精力分析最大的不確定度分量。質(zhì)量m的不確定度有2個(gè)主要來(lái)源：一是重復(fù)性變化，可以通過(guò)10次連續(xù)稱(chēng)量測(cè)量，采用A類(lèi)方法評(píng)定，該重復(fù)性通過(guò)試驗(yàn)合成重復(fù)性考慮；二是天平校準(zhǔn)引入的不確定度，按B類(lèi)方法評(píng)定。

檢定校準(zhǔn)證書(shū)上給出天平在20℃時(shí)的測(cè)量結(jié)果的不確定度U=4.5 mg，k=2，則天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc（m）=4.5÷2=2.2 mg，其相對(duì)不確定度為ur（m）=uc（m）÷m=2.2÷2026=0.001 1。

2.2 體積V、V1、V2不確定度評(píng)定

該不確定度主要有3個(gè)方面：一是重復(fù)性變化，采用A類(lèi)方法評(píng)定，該重復(fù)性也通過(guò)試驗(yàn)合成重復(fù)性考慮；二是校準(zhǔn)不確定度，三是溫度影響，均按B類(lèi)方法評(píng)定。

2.2.1 校準(zhǔn)引入的不確定度分量

根據(jù)檢定校準(zhǔn)證書(shū)，25 mL容量瓶的允差為±0.025 mL，10 mL 移液管的允差為±0.010 mL，5 mL容量瓶的允差為±0.005 mL。假設(shè)均為三角形分布，則包含因子為，因此標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.2.2 溫度系數(shù)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

檢定或校準(zhǔn)是在室溫20℃環(huán)境條件下進(jìn)行的[3]，本研究的溫度波動(dòng)范圍為±3℃（置信水平為95%）。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1假設(shè)正態(tài)分布，其包含因子為1.96。25 mL容量瓶、10 mL移液管和5 mL容量瓶，因溫度控制不充分而產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.3 體積V、V1、V2的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（cV）、uc（V1）、u（cV2）

其相對(duì)不確定度為

2.3 濃度c的不確定度評(píng)定

濃度c的不確定度由3個(gè)部分組成：一是由擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)求得c時(shí)測(cè)量所產(chǎn)生的不確定度；二是標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的純度對(duì)c測(cè)量帶來(lái)的不確定度；三是由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液所產(chǎn)生對(duì)c測(cè)量帶來(lái)的不確定度；均按B類(lèi)方法評(píng)定。

2.3.1 擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)求得c時(shí)引入的不確定度分量

阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，阿散酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積見(jiàn)表2，洛克沙砷標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積見(jiàn)表3，硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積見(jiàn)表4[3，5]。

表1 阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear range，linear equation and correlation coefficient of p-arsanilic acid，4-nitrophenylarsonic acid，3-nitro-4-hydroxyphenylarsonic acid

表2 阿散酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積Table 2 Peak areas of p-arsanilic acid standard working solution

表3 洛克沙砷標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積Table 3 Peak areas of 3-nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid standard working solution

表4 硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積Table 4 Peak areas of 4-nitrophenylarsonic acid standard working solution

依據(jù)試驗(yàn)，對(duì)一份雞肝加標(biāo)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，由峰面積通過(guò)線(xiàn)性回歸方程求得c阿散酸=48.25 μg/L，c洛克沙砷=45.77 μg/L，c硝苯砷酸=46.20 μg/L 則殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度分量

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度分量[6]。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)獲得阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度分別為1 ng/mL（k=2），因此標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋操作的不確定度評(píng)定

進(jìn)行混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋操作引入的不確定度評(píng)定[5]?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備使用經(jīng)檢定或校準(zhǔn)的移液槍和單標(biāo)線(xiàn)A級(jí)容量瓶，進(jìn)行二級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥苫旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用液。因此稀釋倍數(shù)是

根據(jù)計(jì)量檢定證書(shū)，1 mL移液槍、A級(jí)50 mL容量瓶和10 mL容量瓶的允差分別為±0.01 mL、±0.05 mL和±0.03 mL[3]，在（20±3）℃條件下進(jìn)行，其相對(duì)不確定度 為

2.3.4 濃度c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

計(jì)算濃度c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[5-8]。

2.4 回收率的不確定度評(píng)定

進(jìn)行回收率引入的不確定度評(píng)定[9-11]。分別在空白的雞肝基質(zhì)中添加0.50 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)液，包含n=6次平行試驗(yàn)，m=3×6=18，另取兩份作為空白試驗(yàn)，均按照試驗(yàn)方法操作，并且進(jìn)行外標(biāo)法定量，結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)測(cè)量結(jié)果求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為

表5 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Results of test for recovery（n=6）

2.5 重復(fù)性的不確定度評(píng)定

進(jìn)行重復(fù)性引入的不確定度評(píng)定[12-13]。對(duì)同一雞肝樣品進(jìn)行n=11次獨(dú)立重復(fù)性試驗(yàn)，所得阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的總量分別為0.849、0.863、0.852、0.875、0.888、0.869、0.862、0.850、0.883、0.869、0.858 mg/kg，平均值=0.865 mg/kg，采用貝塞爾公式計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于一倍標(biāo)準(zhǔn)偏差；其相對(duì)不確定度為

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定

表6 不確定度各分量的分析結(jié)果Table 6 Uncertainly in each quantity

由表6，其合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[14-15]為：，取包含因子k=2，雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量的擴(kuò)展不確定度：U（X）=k×ur（X）×X=2×0.133×0.865=0.230 mg/kg，該雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量X為：0.865 mg/kg±0.230 mg/kg。

3 結(jié)論

評(píng)定雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量測(cè)量不確定度，分析測(cè)量過(guò)程中存在的不確定度來(lái)源。通過(guò)各不確定度分量的分析與比較得知，使用線(xiàn)性最小二乘法擬合曲線(xiàn)程序的前提是假定橫坐標(biāo)的量的不確定度與縱坐標(biāo)的量的不確定度相差極大，因此濃度c的不確定度計(jì)算程序僅僅與峰面積不確定度有關(guān)，而標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度和逐次稀釋的不確定度足夠小以至于可以忽略；另外，引起測(cè)量不確定度的最主要來(lái)源是測(cè)定c值時(shí)用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)所引入的不確定度。因此，試驗(yàn)人員在實(shí)際操作中應(yīng)引起重視，嚴(yán)格按照高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀操作規(guī)程進(jìn)行操作，定期做好儀器的計(jì)量檢定和期間核查工作，使儀器的技術(shù)性能處于良好狀態(tài)是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段，同時(shí)擇優(yōu)選擇移液器具，從而保證該標(biāo)準(zhǔn)方法可靠，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。