超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中結(jié)晶紫殘留干擾因素分析

劉國紅，張惠南，張敏，劉娟，李淑靜，*

（1.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津天獅學(xué)院，天津301700）

結(jié)晶紫，以N，N-二甲基苯胺為原料，經(jīng)過加工得到成品，是一種三苯基甲烷染料[1]。結(jié)晶紫用途廣泛，多用于消毒、殺菌、生物染色劑、獸藥、飼料等。結(jié)晶紫以其殺菌效果好，保鮮效果佳的特點(diǎn)，多年來廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)品長途運(yùn)輸。然而，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫易被生物組織吸收，在生物體內(nèi)代謝后生成具有致癌、致畸、高毒、高殘留特性的隱性結(jié)晶紫[2-4]。目前很多國家地區(qū)都將結(jié)晶紫列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物，我國目前也將結(jié)晶紫列為可食用動物禁用獸藥。

近年來，可食用動物中違規(guī)使用結(jié)晶紫等藥品的情況備受關(guān)注。歐盟要求水產(chǎn)品中結(jié)晶紫不得檢出。2005年，我國發(fā)布實(shí)施的GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[5]規(guī)定結(jié)晶紫的檢測限為 2.0 μg/kg。

然而，檢測過程中時(shí)常遇到試劑空白檢出結(jié)晶紫，以及分析結(jié)果穩(wěn)定性差的現(xiàn)象。國內(nèi)有學(xué)者對結(jié)晶紫檢測做了相關(guān)研究。吳淑秀等[6]應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了實(shí)驗(yàn)室檢測過程中常用的筆、紙、標(biāo)簽、樣品袋等用品中結(jié)晶紫的含量。結(jié)果表明，大部分供試物品均含有一定量的結(jié)晶紫，其中A4打印紙、標(biāo)簽紙和圓珠筆中含量很高。高華鵬等[7]采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定了結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的含量，結(jié)果顯示出實(shí)驗(yàn)室用品均能檢出結(jié)晶紫。許榮富等[8]用反相柱成功地分離出了結(jié)晶紫、甲基紫、堿性品藍(lán)、堿性艷藍(lán)B、銅酞菁和羅丹明B等幾種有色染料成分，檢測出圓珠筆的結(jié)晶紫含量。

本文針對水產(chǎn)品檢測過程中結(jié)晶紫檢測干擾因素進(jìn)行分析，在不同的時(shí)間條件下，對試驗(yàn)可能接觸的辦公用品如紙、筆、標(biāo)簽紙，以及包裝材料如留樣用塑料袋中的結(jié)晶紫含量進(jìn)行檢測，從而得出隨時(shí)間變化的干擾因素對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A4打印紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙、黑色簽字筆、黑色馬克筆、藍(lán)色圓珠筆：得力集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)室濾紙：塘玻（天津）實(shí)驗(yàn)儀器銷售有限公司；留樣用塑料袋：河源市華豐塑膠有限公司。

乙腈（色譜純）：德國默克公司；乙酸銨（優(yōu)級純）：天津科密歐化學(xué)試劑公司；結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫：德國Dr.Ehrensorfer公司。

1290/6460超 高效液質(zhì)聯(lián)用儀、Eclipse Plus色譜柱C18（5μm×100mm×2.1mm）：德國 Agilent公司；AL204-IC電子天平：上海梅特勒-托利多儀器；WAT200609固相萃取裝置：沃特世Waters公司；HS501振蕩器：IKA公司；1 mL/cc一次性使用無菌注射器：浙江華福醫(yī)用器材有限公司；尼龍膜過濾器（0.22 μm，13 mm）：博納艾杰爾科技有限公司；1 mL進(jìn)樣瓶：浙江愛吉仁科技有限公司；2 mL塑料滴管：上海晶安生物信息有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

0.1 μg/mL的結(jié)晶紫工作液的配制：精確移取0.01 mL 0.1 mg/mL的結(jié)晶紫中間液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線于4℃以下避光儲存搖勻備用。

1.2.2 樣品前處理

將待測的A4紙、實(shí)驗(yàn)室濾紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙和留樣用塑料袋分別裁剪成2 cm×2 cm同樣大小的紙片，如圖1所示。把待測所用黑色簽字筆、黑色馬克筆、藍(lán)色圓珠筆分別在2 cm×2 cm的空白實(shí)驗(yàn)室濾紙上用力均勻[9]地分別書寫一條、兩條、四條長度為兩厘米的印記并晾干，如圖2所示。加入2 mL乙腈浸提5 min，渦旋振蕩5 min。浸提液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

圖1 紙樣品前處理Fig.1 Pre-processing of paper sample

圖2 筆樣品前處理Fig.2 Pre-processing of pen sample

1.2.3 不同提取時(shí)間對污染物含量影響

將裁剪好的相同濾紙中畫相同兩條黑色簽字筆印記的紙、畫有相同黑色馬克筆印記的濾紙、畫有相同藍(lán)色圓珠筆印記的濾紙、相同送樣樣品標(biāo)簽紙、相同激光打印標(biāo)簽紙、相同留樣用塑料袋分別放入50 mL離心管中，加入2 mL乙腈分別浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min，浸提液經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測污染物（顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫）含量。重復(fù)5次作為平行試驗(yàn)，從而減小誤差。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18，1.8 μm×100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑）；流動相：A為500 mL乙腈+500 μL甲酸+0.385 g乙酸銨，B 為乙腈；流速：300 μL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient condition of mobile phase

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiplereactionmonitoring，MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；殼氣溫度：350℃；離子源溫度：300℃。

顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫檢測的質(zhì)譜條件見表2。

表2 顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometer conditions for gentian violet and leuco gentian violet

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確分別吸取結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)工作液0、1、5、10、20、50、100 μL 至進(jìn)樣瓶內(nèi)，依次分別加入乙腈 1 000、999、995、990、980、950、900 μL 至每個(gè)進(jìn)樣瓶內(nèi)，配制成濃度為 0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)液。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液置于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，在最佳色譜條件下進(jìn)行色譜分析，以保留時(shí)間定性，測定峰面積定量。以結(jié)晶紫及其代謝物濃度為橫坐標(biāo)，以結(jié)晶紫及其代謝物的液相峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的檢出限

圖3和圖4分別為0.05 μg/L顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的選擇離子色譜圖。

圖3 0.05 μg/L顯性結(jié)晶紫選擇離子色譜圖Fig.3 MRM chromatography for 0.05 μg/L gentian violet

圖4 0.05 μg/L隱性結(jié)晶紫選擇離子色譜圖Fig.4 MRM chromatography for 0.05 μg/L leuco gentian violet

在0.5 μg/L濃度下，顯性結(jié)晶紫的信噪比S/N=17.5，隱性結(jié)晶紫的信噪比S/N=71.9，均大于3，按照GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定，S/N＞3可以定義為檢出限。因此本方法中顯性結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫的檢出限定為0.5 μg/L。由圖3和圖4可得，該試驗(yàn)條件測得的顯性結(jié)晶紫的保留時(shí)間為5.81 min，隱性結(jié)晶紫的保留時(shí)間為7.52 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.5的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以結(jié)晶紫的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=150 049.37X+12 345.95，相關(guān)系數(shù) R2＝0.995 7，線性范圍為 0～5 μg/L，線性關(guān)系良好。

以隱性結(jié)晶紫的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=56 370.42X-2 861.45，相關(guān)系數(shù) R2＝0.999 5，線性范圍為 0～5 μg/L，線性關(guān)系良好。

2.3 結(jié)晶紫隨時(shí)間變化的含量分析

6種待分析樣品結(jié)晶紫殘留含量結(jié)果見表3。

表3 結(jié)晶紫隨時(shí)間變化的含量分析Tab.3 Analysis on the content of gentian violet changed over time

由表3可得出在對6種待分析樣品分別浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min 后檢測結(jié)晶紫含量，黑色簽字筆劃線紙沒有檢出顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫含量，黑色馬克筆劃線紙和留樣用塑料袋中沒有檢出隱性結(jié)晶紫含量。在5 min～720 min內(nèi)黑色馬克筆劃線紙中的顯性結(jié)晶紫含量隨時(shí)間的延長而增加。在720 min時(shí)達(dá)到頂峰，其濃度為0.30 μg/L。其原因可能是由于隨時(shí)間的增加馬克筆油墨中的染料含有的污染物不斷析出[10]。在5 min～720 min內(nèi)藍(lán)色圓珠筆劃線紙中顯性結(jié)晶紫含量非常高且隨時(shí)間的加長而增加，在720 min時(shí)達(dá)到頂峰，其濃度為392.96 μg/L。其隱性結(jié)晶紫含量也隨時(shí)間的延長而增加。藍(lán)色圓珠筆劃線紙中含有的顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫含量非常高，原因可能是由于圓珠筆油墨中的染料含有結(jié)晶紫所以對試驗(yàn)造成了極大的污染，并且隨時(shí)間增加污染物在不斷的析出[9]。送樣樣品標(biāo)簽紙中顯性結(jié)晶紫隨時(shí)間的延長而增加，其濃度在720 min時(shí)達(dá)到頂峰濃度為51.30 μg/L。其隱性結(jié)晶紫含量也隨時(shí)間的加長而增加。其原因可能是由于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)簽紙?jiān)谏a(chǎn)運(yùn)輸時(shí)受到結(jié)晶紫的污染。激光打印標(biāo)簽紙中顯性結(jié)晶紫隨時(shí)間的加長而增加，其隱性結(jié)晶紫含量也基本隨時(shí)間的加長而增加，其原因可能是由于激光打印的墨汁中含有結(jié)晶紫。留樣用塑料袋中顯性結(jié)晶紫含量整體隨時(shí)間的加長而增加。存在顯性結(jié)晶紫的原因可能是由于在塑料袋的保存和運(yùn)輸過程中受到含有結(jié)晶紫物質(zhì)的污染。

3 結(jié)論與討論

本文研究超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品測定過程中可能存在的干擾因素，包括水產(chǎn)品的樣品采集、流通，以及實(shí)驗(yàn)室檢測過程中可能被污染的包裝材料樣本中結(jié)晶紫含量隨時(shí)間變化的情況。除了黑色簽字筆劃線紙沒有測定出顯性及隱性結(jié)晶紫以外，在黑色馬克筆劃線紙、藍(lán)色圓珠筆劃線紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙、留樣用塑料袋中顯性結(jié)晶紫的含量變化趨勢一致，都隨時(shí)間的延長有增長趨勢。藍(lán)色圓珠筆劃線紙中的隱性結(jié)晶紫含量也很高，5 min～720 min時(shí)隱性結(jié)晶紫從8.18 μg/L升高到15.90 μg/L，隨時(shí)間延長含量出現(xiàn)了增長。送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙中隱性結(jié)晶紫含量也有了不同程度的檢出，同樣隨時(shí)間延長出現(xiàn)了增長。黑色馬克筆劃線紙、留樣用塑料袋中沒有檢出隱性結(jié)晶紫。

綜上所述，結(jié)晶紫（含顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫）檢測結(jié)果在樣品采集、傳遞及實(shí)驗(yàn)室檢測過程中會受包裝材料的影響，原因是馬克筆、圓珠筆，激光打印的墨粉中的結(jié)晶紫染料可能析出，染料中析出的結(jié)晶紫檢出值隨時(shí)間延長而升高。該研究為探索水產(chǎn)品中結(jié)晶紫檢測受包裝材料的影響情況提供了依據(jù)，為結(jié)晶紫檢測假陽性研究提供了參考。