干燥加熱磷酸化修飾對鴨蛋清蛋白結(jié)構(gòu)和抗氧化活性影響的研究

劉自單，殷春雁，李燦鵬

（1.紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南紅河661199；2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650091）

機(jī)體的抗氧化能力依賴于抗氧化物質(zhì)對氧自由基的清除能力[1]。正常情況下，抗氧化物質(zhì)與自由基之間的作用處于平衡狀態(tài)，平衡破壞可能導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷，甚至導(dǎo)致心血管疾病和癌癥[2]。因此，迫切需要尋找一種安全、易吸收、營養(yǎng)、可食用，并具有很好抗氧化性的食品。鴨蛋是中國食品生產(chǎn)中最常用的蛋類之一，鴨蛋清蛋白（duck egg white protein，DEWP）容易被人體腸道所吸收[3]。目前，食品抗氧化性研究主要集中在從植物和動物資源中提取蛋白質(zhì)[4]及篩選抗氧化肽，例如魚類蛋白[5]、海產(chǎn)品[6]、牛奶[7]等，并且多集中在采用酶解法篩選抗氧化多肽[8-9]。

本課題組一直致力于采用干燥加熱磷酸化修飾法對蛋清蛋白理化性質(zhì)和功能進(jìn)行研究，例如熱穩(wěn)定性[10-14]、起泡性和乳化性[11，14-16]、吸油性[14]、凝膠特性和膠體保水性[11，13]、被消化性[11]、磷酸鈣可溶性[10-13]和抗氧化性[17]。干燥加熱磷酸化過程中未加入有機(jī)試劑，是一種比較安全、簡單、環(huán)保且容易實現(xiàn)工業(yè)化的食品改性方法。目前，已經(jīng)報道了鴨蛋清蛋白具有抗氧化性[4]，但鴨蛋清蛋白經(jīng)磷酸化修飾后是否能影響其抗氧化性的研究尚未報道。本研究旨在確定干燥加熱磷酸化修飾對鴨蛋清蛋白抗氧化的影響，為抗氧化性功能食品的開發(fā)提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鴨蛋清蛋白的制備參照Naknukool等[3]的方法略作修改。具體為：取出新鮮鴨蛋蛋清，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0，6 000 r/min離心20 min。取出上清液用10 kDa的透析袋透析1 d。凍干后獲得鴨蛋清蛋白（native-duck egg white protein，N-DEWP）樣品。

1.1.2 試劑

2，2-二氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）-二銨鹽（ABTS）、乙二胺四乙酸二鈉：上海伊卡生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；亞鐵嗪：Sigma；重硫酸鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。其余試劑均為分析純試劑。

1.1.3 儀器

UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；PHS-25型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；FA 2004型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；實驗室超純水機(jī)：重慶圣德利醫(yī)療器械研究有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 干燥加熱磷酸化鴨蛋清蛋白（phosphorylation of duck egg white protein，PP-DEWP）的制備

干燥加熱磷酸化鴨蛋清蛋白的制備采用Li等[10]的方法。稱取1 g N-DEWP樣品，用焦磷酸鈉溶液（100 mL，0.1 mol/L） 溶解，調(diào)節(jié) pH 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，凍干，然后85℃干燥加熱1 d和3 d。用適量去離子水溶解干燥加熱之后的樣品，裝入透析袋中透析2 d，再次冷凍干燥，得到干燥加熱磷酸化鴨蛋清蛋白（PP-DEWP）樣品。干燥加熱鴨蛋清蛋白（dry-heating of duck egg white protein，DH-DEWP）樣品的制備除不加入焦磷酸鈉溶液外，同以上步驟。

1.2.2 磷含量的測定

樣品中磷含量采用Chen等[18]的方法?？偭缀浚≒t）的測定：在分解瓶中用2 mL 60%的高氯酸溶解10 mg蛋白樣品，然后在電爐上加熱至溶液澄清，繼續(xù)加熱30 min。冷卻后加入10 mL去離子水，沸水浴20 min，冷卻后定容到100 mL。配制混合液，混合液包括：（1）3 mol/L 稀 H2SO4，（2）2.5%鉬酸銨溶液，（3）10%的抗壞血酸，按照體積比（1）∶（2）∶（3）∶蒸餾水=1 ∶1 ∶1∶2混合。分別取2 mL不同濃度的磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液和定容后的PP-DEWP溶液，加入等體積的混合液，50℃水浴1 h，冷卻后測定吸光度（820 nm）。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線求出總磷含量。無機(jī)磷含量（Pi）的測定：在分解瓶中加入20 mg左右的PP-DEWP樣品，加入5 mL水，再加入5 mL 10%三氯乙酸。3 000 r/min離心2 h，取上清液1mL定容到10 mL。分別取2 mL不同濃度的磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液和PP-DEWP樣品稀釋液，加入等體積的混合液，混勻后在50℃水浴中加熱1 h，冷卻后在820 nm處測定吸光度值。

式中：Po為磷酸化修飾后樣品中的磷含量，%；Pt為樣品中總磷含量，%；Pi為樣品中無機(jī)磷含量，%。

1.2.3 溶解性測定

樣品的溶解性采用Lowry等方法[19]測定。將N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP樣品分別溶解在Tris-HC（l50 mmol/L，pH=7.0）的緩沖溶液中，調(diào)節(jié)濃度為1 mg/mL。3 000 r/min離心30 min得上清。配制0、0.05‰、0.15‰、0.20‰、0.25‰、0.30‰的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制混合液，混合液中各成分為（1）含10%Na2CO3的 0.5 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液，（2）1%的五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液，（3）2%的酒石酸鉀鈉溶液，體積比為（1）∶（2）∶（3）=20 ∶1 ∶1。取 0.5 mL 不同濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和0.5 mL待測樣品液，各加入混合液1 mL，25℃放置10 min，分別加入2 mL 1 mol/LFolin-酚試劑，50℃水浴加熱15 min，冷卻后，在500 nm處測定容液的吸光度。

1.2.4 表面巰基含量測定

表面巰基含量測定采用Ellman等[20]的方法。將N-DEWP、DH-DEWP、PP-DEWP 樣品分別溶解在0.1 mol/L Tris-甘氨酸（pH=8.0）緩沖液中，使其濃度為1 mg/mL。在1.0 mL蛋白溶液中加入1.0 mL 0.1 mol/L Tris-甘氨酸（pH=8.0）的緩沖液（含0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液），在40℃加熱30 min，再加入50 μL 5，5′-二硫代雙（二硝基苯甲酸）[5，5′-二硫代雙（二硝基苯甲酸）溶液（濃度為1 mol/L）用0.1 mol/L pH 8.0的Tris-甘氨酸的緩沖液溶解]，在25℃水浴中加熱10 min，在412 nm處測定其吸光度。計算公式：SH=A×1.953 9。

1.2.5 濁度和吸光度測定

濁度測定采用Li等[11]的方法。配制2 mg/mL的N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP溶液，在595 nm處測定吸光度值即為濁度。配制1 mg/mL的N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP蛋白溶液，在280 nm處測定吸光度值。

1.2.6 熱穩(wěn)定性測定

蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性測定參考Li等[12]的方法，配制50 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）的緩沖溶液，稱取一定量的N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP樣品溶解于上述緩沖液中配成1 mg/mL的樣品溶液，分別在60、70、80、90、100℃水浴加熱 10 min，3 000 r/min 離心30 min，取上清液用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度。離心前先用相機(jī)拍攝圖片作為定性對比。

1.2.7 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力根據(jù)Zhang等[21]的方法測定。7 mmol/L ABTS溶液：稱取38.41 mg ABTS溶解在5 mL去離子水中；2.45 mmol/L重硫酸鉀：稱取6.61 mg重硫酸鉀溶解在5 mL去離子水中；兩溶液混合均勻，避光條件下放置16 h～24 h（讓其充分氧化）。使用時用100 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液按照體積比1∶70稀釋使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。取稀釋好的ABTS溶液4 mL，加入用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制好的 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL 樣品溶液各80 μL混勻，37℃水浴放置10 min，測定734 nm處的吸光度。平行3次，空白不加樣品，以等量的磷酸鹽緩沖液代替，樣品抗氧化率計算如下。

式中：As為樣品的吸光度；A為空白的吸光度。

1.2.8 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基清除能力根據(jù)Zhang等[22]的方法測定。稱取一定量蛋白，用50 mmol/L pH 8.2 Tris-HCl緩沖液溶解蛋白質(zhì)使其濃度為1 mg/mL。移取3 mL樣品溶液，加入在25℃水浴中恒溫的0.14上mL 5mmol/L鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl溶液配制），混勻，快速倒入比色皿中，每30 s測定325 nm處的吸光度，測定4 min。空白組以等量的10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液；對照組以等量去離子水代替樣品。做吸光度隨時間變化的曲線回歸方程，求出其斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率和樣品組對鄰苯三酚的自氧化速率，計算如下。

式中：V樣品為樣品組對鄰苯三酚的自氧化速度；V對照為鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.9 二價鐵離子的螯合能力

二價鐵離子螯合能力采用Wu等[23]的方法測定。配制 0.1、1.0、5.0、10.0 mg/mL 的樣品溶液，各取 1 mL加入3.7 mL水，再加入2.0 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液0.2 mL，混勻，25℃下水浴60 min。加入5 mmol/L的亞鐵嗪溶液0.2 mL，混勻，25℃下水浴10 min，在562 nm處測定吸光度。平行3次，空白不加樣品，以等量的去離子水代替，蛋白對二價鐵離子的螯合能力計算如下。

式中：As為樣品的吸光度；A為空白的吸光度。

1.2.10 色氨酸的熒光強度

色氨酸熒光強度采用Li等[24]的方法測定。用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）配置濃度為1.5 mg/mL的樣品溶液。離心后取上清，用Lowry法準(zhǔn)確測定上層液中樣品的濃度，然后用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）稀釋為0.1 g/L。在激發(fā)波長為280 nm，測定波長為300 nm～450 nm的條件下，用熒光光度計（F4500型）測定色氨酸的熒光強度。

1.2.11 紅外光譜

紅外光譜測定參照Wu等[25]的方法。取適量樣品粉末和一定量的KBr晶體在研缽中研碎，壓片，用傅立葉紅外光譜儀（Nicolet AVATAR 360 FT-IR）測定紅外光譜。

1.2.12 圓二色譜測定

圓二色譜測定參照Wu等[25]的方法，用50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制1 mg/mL的樣品溶液，用0.45 μm的濾頭過濾，用Lowry法測定樣品的準(zhǔn)確濃度，調(diào)節(jié)為0.1 mg/mL。20℃下掃描，掃描的相關(guān)參數(shù)為波長范圍：190 nm～250 nm；譜帶寬度：1 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥加熱磷酸化鴨蛋清蛋白的特性

2.1.1 磷酸化鴨蛋清蛋白中的磷含量

磷含量是干燥加熱磷酸化后接在蛋白質(zhì)上的有機(jī)磷含量，即有機(jī)磷含量=總磷含量-無機(jī)磷含量。磷含量與pH值、干燥加熱時間和溫度等因素有關(guān)，本試驗采用Li等[10]的方法成功制備磷酸化鴨蛋清蛋白樣品并優(yōu)化了影響樣品磷酸化的條件[16]，pH值對磷含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 pH值對磷酸化鴨蛋清蛋白中磷含量的影響Fig.1 Effect of pH on the phosphorus content in duck egg white protein phosphorylated by dry-heating in the presence of pyrophosphate（PP-DEWP）

從圖1中可以看出，pH值不同，即使加熱時間都是1 d，磷含量也不同，pH值為5.0、85℃干燥加熱1 d獲得的樣品有機(jī)磷含量達(dá)到1.18%。同時研究了加熱天數(shù)1 d和3 d，發(fā)現(xiàn)隨著加熱天數(shù)增加，磷含量增加，pH值為5.0、85℃干燥加熱3 d獲得的樣品有機(jī)磷含量為1.22%。因此磷酸化樣品條件確定為：pH值為5.0、85℃干燥加熱3 d。Li等[11]采用干燥加熱磷酸化法修飾雞蛋卵白蛋白樣品，在pH值為4、85℃干燥加熱5d條件下測定有機(jī)磷含量為1.01%。研究表明蛋白質(zhì)中磷的含量能夠提高其功能特性，如熱穩(wěn)定性，Kitabatake等[26]報道了當(dāng)卵白蛋白含有兩個磷酸基團(tuán)，測定磷含量為0.14%，熱穩(wěn)定性比去磷酸化的卵白蛋白更好。

2.1.2 磷酸化鴨蛋清蛋白溶解度測定

本試驗采用Lowry等[19]方法測定樣品溶解度，結(jié)果見表1。

表1 磷酸化鴨蛋清蛋白的特性Table 1 Some characteristics of PP-DEWP

如表1所示，與未經(jīng)過任何處理的鴨蛋清蛋白（N-DEWP）相比，未加入焦磷酸鹽干燥加熱的鴨蛋清蛋白（DH-DEWP）溶解度有所下降。但在焦磷酸鹽存在條件下干燥加熱的鴨蛋清蛋白（PP-DEWP）溶解度達(dá)到99.2%，與N-DEWP溶解度相當(dāng)。表明干燥加熱磷酸化改善了鴨蛋清蛋白的溶解性。這些結(jié)果與前期報道一致[10-11，17]。研究表明平均疏水性越低，靜電荷越多，蛋白質(zhì)溶解性越高[27]。干燥加熱磷酸化使鴨蛋清蛋白溶解度增高可能是由于引入的磷酸基團(tuán)親水作用的結(jié)果。

2.1.3 磷酸化鴨蛋清蛋白巰基含量測定

表面巰基含量的測定采用Ellman等[20]的方法。如表1所示，N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的表面巰基含量分別為0.144、0.156mol/mol和0.164mol/mol。這是因為干燥加熱使N-DEWP的結(jié)構(gòu)展開，表面巰基含量增加[28]，干燥加熱磷酸化后結(jié)構(gòu)展開的更多，表面巰基進(jìn)一步增加[13]。有研究表明蛋白質(zhì)的表面巰基增加會使抗氧化性提高[29]。

2.1.4 渾濁度和吸光度值

由表 1可知，N-DEWP（濃度2 mg/mL）在 595 nm處的吸光度值為0.046，此時溶液為澄清透明。DHDEWP的渾濁度略微升高，但PP-DEWP的渾濁度低于N-DEWP和DH-DEWP，表明干燥加熱磷酸化能夠抑制干燥加熱引起的渾濁增加。這很可能是由于PPDEWP中磷酸基團(tuán)的靜電排斥力引起的[13]。從表1可以看出，N-DEWP、DH-DEWP 和 PP-DEWP（濃度1mg/mL）在280 nm處的吸光度值為0.759、0.831和0.820。干燥加熱和干燥加熱磷酸化后吸光度值略微增加。

2.1.5 熱穩(wěn)定性檢測

通過定性和定量分析來檢測磷酸化作用對鴨蛋清蛋白熱穩(wěn)定性的影響。將N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP樣品分別置于不同的溫度（60℃～100℃，間隔為10℃）下水浴加熱10 min，離心后用lowry法測定上清液中可溶性蛋白的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP樣品在不同溫度下的熱穩(wěn)定性Fig.2 Heat stability of N-DEWP，DH-DEWP andPP-DEWP at various temperatures

如圖2所示，當(dāng)水浴溫度達(dá)到70℃以后，隨著溫度升高，N-DEWP、DH-DEWP樣品溶解度顯著降低。而經(jīng)過干燥加熱磷酸化的樣品（PP-DEWP）在70℃的溶解度仍大于90%。如圖2的照片所示，當(dāng)溫度達(dá)到80℃，N-DEWP、DH-DEWP溶液開始渾濁并沉淀，而PP-DEWP溶液在所有溫度下（60℃～100℃）均保持透明（圖片文字清晰可見）。表明干燥加熱磷酸化作用顯著增強了鴨蛋清蛋白的熱穩(wěn)定性，這可能是由于磷酸基團(tuán)的引入導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間排斥力增強的結(jié)果。這一結(jié)果與Li等用雞蛋清蛋白[11]和卵白蛋白[12]研究的結(jié)果一致。

2.2 磷酸化對鴨蛋清蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 色氨酸的熒光強度

為檢測干燥加熱磷酸化對鴨蛋清蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響，測定N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的色氨酸熒光強度，結(jié)果見圖3。

圖3 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的色氨酸熒光光譜Fig.3 Tryptophan（Trp）flfluorescence spectra of N-DEWP，DH-DEWP and PP-DEWP

如圖3所示，經(jīng)過干燥加熱磷酸化之后，鴨蛋清蛋白的色氨酸熒光強度有所降低。這些結(jié)果暗示了干燥加熱磷酸化導(dǎo)致鴨蛋清蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使更多的色氨酸殘基暴露到溶劑中。與Enomoto等[30]報道的干燥加熱對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)影響不太明顯這一結(jié)果一致。

2.2.2 圓二色譜（circular dichroism，CD）測定

蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)在192 nm附近有一正峰，在208 nm和222 nm處有兩個特征性的肩峰，因此可以利用CD圖譜判斷蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。

圖4 干燥加熱磷酸化修飾對N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of phosphorylation on the secondary structure of N-DEWP，DH-DEWP and PP-DEWP

如圖4所示，與N-DEWP相比，經(jīng)過干燥加熱和磷酸化后，DH-DEWP和PP-DEWP在222 nm處的特征值略微升高，但蛋白總體結(jié)構(gòu)并未發(fā)生較大變化。表明干燥加熱磷酸化修飾對鴨蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)影響不大[13]。

2.2.3 紅外光譜

通過紅外光譜測定了N-DEWP、DH-DEWP和PPDEWP，結(jié)果見圖5。

圖5 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的紅外光譜Fig.5 FTIR spectra of N-DEWP，DH-DEWP and PP-DEWP

蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶都對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有影響，酰胺Ⅰ帶在1 600 cm-1～1 700 cm-1處有吸收（主要是C=O），酰胺Ⅱ帶在1 540 cm-1處有吸收（主要是C-N鍵和N-H鍵）[31]。如圖5所示，當(dāng)干燥加熱磷酸化后，鴨蛋清蛋白的酰胺Ⅰ帶的峰值從1 647 cm-1遷移到1 641 cm-1，酰胺Ⅱ帶峰值從1 531 cm-1遷移到1 535 cm-1，表明干燥加熱磷酸化修飾使鴨蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)受到一定影響。

2.3 磷酸化對鴨蛋清蛋白抗氧化活性的影響

2.3.1 ABTS+自由基清除能力

樣品中含有的抗氧化成分會與ABTS反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色，通過測定ABTS+自由基在最大吸收波長（734 nm）處的吸光度來進(jìn)行定量分析[32]，結(jié)果見圖6。

圖6 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 ABTS+free radical scavenging effects of N-DEWP，DH-DEWP，and PP-DEWP

如圖6所示，隨著蛋白濃度（0.5 mg/mL～10 mg/mL）的增加，N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP對ABTS+自由基的清除能力逐漸增大。在相同濃度下，N-DEWP和DH-DEWP對ABTS+自由基的清除能力均低于PP-DEWP。在10 mg/mL蛋白濃度時，PP-DEWP對ABTS+自由基的清除能力提高到了77.78%。表明干燥加熱磷酸化顯著提高了鴨蛋清蛋白對ABTS+自由基的清除能力。結(jié)果與之前的報道一致[17]。

2.3.2 超氧陰離子自由基的清除能力

N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的超氧陰離子自由基清除能力如圖7所示。

圖7 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP對超氧陰離子的清除能力Fig.7 Superoxide anion scavenging activity of N-DEWP，DHDEWP，and PP-DEWP

PP-DEWP的超氧陰離子自由基清除能力（7.69%）高于N-DEWP（4.73%）和DH-DEWP（5.32%）。表明干燥加熱能夠提高鴨蛋清蛋白的超氧陰離子清除能力，干燥加熱磷酸化能夠進(jìn)一步提高鴨蛋清蛋白的超氧陰離子清除能力。

2.3.3 二價鐵離子的螯合能力

某些蛋白質(zhì)螯合劑可以通過改變過渡金屬的物理位置形成不溶性金屬配合物，降低過渡金屬的化學(xué)反應(yīng)活性[33]。對N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP的二價鐵離子螯合能力測定結(jié)果如圖8所示。

隨著蛋白濃度（0.1 mg/mL～10 mg/mL）的增加，N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP對二價鐵離子的螯合能力逐漸增大。PP-DEWP的二價鐵離子螯合能力比DH-DEWP顯著提高，表明磷酸基團(tuán)的引入能增加鴨蛋清蛋白對二價鐵離子的螯合能力。眾所周知，EDTA是很好的螯合劑，被廣泛用于食品中。在本試驗中，當(dāng)PP-DEWP的濃度大于1 mg/mL時，螯合能力與EDTA基本相等。PP-DEWP的螯合能力表明它是一種很好的抗氧化劑，有望在食品中應(yīng)用。

圖8 N-DEWP、DH-DEWP和PP-DEWP對二價鐵離子的螯合能力Fig.8 Chelating capacity of N-DEWP，DH-DEWP，and PP-DEWP

3 討論與結(jié)論

鴨蛋清蛋白經(jīng)過干燥加熱磷酸化修飾后抗氧化性顯著提高的原因可能包括如下兩個方面。第一，干燥加熱磷酸化修飾作用引入帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)使鴨蛋清蛋白的靜電相互作用增強。第二，干燥加熱磷酸化修飾作用增加了鴨蛋清蛋白的表面巰基含量。研究表明表面巰基含量的增加能夠提高蛋白質(zhì)的總體抗氧化性[29，34]，?ilic′等[35]也以玉米蛋白為樣品確定了表面巰基的含量和抗氧化性存在正相關(guān)。因此，可以肯定本研究中鴨蛋清蛋白抗氧化性的增強是因為干燥加熱磷酸化增加了鴨蛋清蛋白的表面巰基含量。

本文采用干燥加熱磷酸化法修飾鴨蛋清蛋白，得到干燥加熱磷酸化鴨蛋清蛋白（PP-DEWP）樣品，通過綜合評價干燥加熱磷酸化前后鴨蛋清蛋白的抗氧化性，得出結(jié)論干燥加熱使鴨蛋清蛋白的抗氧化性有所提高，干燥加熱磷酸化修飾后其抗氧化性顯著提高，尤其是螯合能力與EDTA基本相等。通過磷酸化修飾，鴨蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)輕度改變，但表面巰基含量增加且蛋白質(zhì)的溶解性、渾濁度和吸光度基本未受影響。可以肯定磷酸化修飾之后抗氧化性提高是由于磷酸親水基團(tuán)的引入和表面巰基含量的增加。以上結(jié)論表明PP-DEWP是很好的抗氧化劑，有望用于食品加工行業(yè)中的添加劑。