星型膠質(zhì)細(xì)胞源外泌體的研究進(jìn)展

李蘇亞，李在望，曹婷婷，張劍平

星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞類型，具有提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞外離子濃度、協(xié)助神經(jīng)元代謝等多種神經(jīng)支持功能[1,2]。AS 對(duì)CNS的病理損傷（缺血缺氧、炎癥、外傷、腫瘤等）極其敏感，并產(chǎn)生反應(yīng)性增生，引發(fā)一系列病理生理改變。外泌體是細(xì)胞分泌的一種膜囊泡，在細(xì)胞通訊、疾病發(fā)生發(fā)展、生物標(biāo)志物的載體等方面具有潛在功能。研究證實(shí)，AS 在CNS 生理和病理狀態(tài)中發(fā)揮的功能都與其外泌體密切相關(guān)[1,3,4]。本文將圍繞AS 源外泌體的發(fā)現(xiàn)、組成與功能及其在CNS疾病中的應(yīng)用展開綜述。

1 AS源外泌體的概述

1.1 AS源外泌體的發(fā)現(xiàn)及提取方法

二十世紀(jì)初，研究者們就發(fā)現(xiàn)了AS 的強(qiáng)大分泌潛能[5]。外泌體是一群直徑為40～100 nm的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)囊泡[6,7]，可由幾乎所有類型的細(xì)胞分泌，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、AS和神經(jīng)干細(xì)胞[8]。從2007 年開始，陸續(xù)有研究小組發(fā)現(xiàn)AS 培養(yǎng)液中存在外泌體[9,10]。Taylor 等[9]發(fā)現(xiàn)AS在氧化作用和熱應(yīng)激下可釋放外泌體，其形成過程先是由細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)小泡，小泡進(jìn)一步發(fā)展形成多囊泡體，在一定的刺激下多囊泡體與細(xì)胞質(zhì)膜融合并釋放到胞外，然后與其他的細(xì)胞質(zhì)膜融合并發(fā)揮作用。

目前已有嚴(yán)謹(jǐn)且成熟的方法來提取并鑒定生物樣品中的AS源外泌體。一般通過收集細(xì)胞上清體外獲取外泌體，主要提取方法有超速離心法、超濾法、梯度密度離心法、免疫磁珠法和試劑盒提取法等[1,10]。目前常用超速離心法，以原代AS（用新生大鼠的皮質(zhì)制備）為例，將AS條件培養(yǎng)基低速離心消除細(xì)胞碎片后，逐步提高離心速度獲得沉淀，將所得沉淀在緩沖液中洗滌、重懸并再次超速離心取沉淀，即可初步得到外泌體。進(jìn)一步采用免疫磁珠法純化并保證其完整性[10]。此外，還需要通過動(dòng)態(tài)光散射顯示微泡群、透射電鏡觀察形狀、Western blotting證實(shí)標(biāo)記物、流式細(xì)胞術(shù)定量分析等方法驗(yàn)證所得到的微囊泡是AS源外泌體[8,11]。

1.2 AS源外泌體的組成及功能

AS 源外泌體是一個(gè)“納米球”，腔內(nèi)充滿各種細(xì)胞蛋白、核酸、脂質(zhì)、可溶性因子（包括細(xì)胞因子、趨化因子、酶和輔因子）[10,12]，可將供體細(xì)胞的信息通過其攜帶的蛋白質(zhì)、mtDNA、miRNA 等傳遞到周邊的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞之間的信息交流及物質(zhì)交換[10,13]。早有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胞外鉀離子水平升高時(shí)，AS 源外泌體釋放突觸蛋白-1，可能對(duì)神經(jīng)突的生長(zhǎng)和神經(jīng)元的存活有積極的影響[14]。也有報(bào)道稱AS可能利用外泌體運(yùn)輸興奮性氨基酸轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白（excitatory amino-acid transporters，EAAT）-1 和EAAT-2，該類蛋白是維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)的基本成分，進(jìn)而維持神經(jīng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)在AS 源外泌體中有熱休克蛋白70 及AS 特異性糖酵解酶的存在[9,16]。這些蛋白是否可能轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元中，從而對(duì)神經(jīng)元的功能產(chǎn)生影響？近來有研究發(fā)現(xiàn)，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）中，AS 可通過外泌體釋放有毒因子介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡[17]。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到一系列如缺氧、低血糖和缺血等應(yīng)激損傷時(shí)，AS 可釋放含有非致病性朊蛋白（朊蛋白是一種可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激、缺氧、缺血和低血糖侵害的蛋白質(zhì)[18]）的外泌體，這些外泌體可以轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元內(nèi)，起到神經(jīng)保護(hù)作用[19]。由上述的這些研究結(jié)果來看，AS源外泌體的確可以對(duì)神經(jīng)元的功能產(chǎn)生一定的影響。

1.3 AS源外泌體在CNS疾病的病理生理過程中的作用

當(dāng)AS 受到炎癥刺激時(shí)，可通過釋放外泌體影響其他神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而推動(dòng)或抑制病程發(fā)展。ALS 是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中最多見的類型，是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，表現(xiàn)為上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害。AS 在疾病進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]。有人在家族性超氧化物歧化酶（copper-zinc superoxide dismutase，SOD）-1突變型ALS的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)突變型SOD1 的AS 可通過分泌外泌體有效地將突變型SOD1 轉(zhuǎn)移到脊髓神經(jīng)元，并選擇性誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡[17,21]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，異質(zhì)性和侵襲性是其主要特征[22]。已有證據(jù)表明，由腦瘤衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性及惡性程度[22-24]。有報(bào)道稱，膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體，可以改變局部環(huán)境使腫瘤自身受益，利用鄰近的AS促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，甚至可能將AS 轉(zhuǎn)化為致瘤表型[11]，受到腫瘤影響的AS 可通過分泌外泌體實(shí)現(xiàn)miR-19a 的功能轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制腫瘤抑制因子同源性磷酸酶（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達(dá)，促進(jìn)腦內(nèi)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[1,25]。帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，以路易小體黑質(zhì)內(nèi)選擇性的多巴胺神經(jīng)元變性為特征，而路易小體主要由α-突觸核蛋白和泛素化蛋白組成。神經(jīng)源性外泌體可在神經(jīng)元細(xì)胞和AS之間轉(zhuǎn)移α-突觸核蛋白毒素，從而促進(jìn)PD 的傳播。AS 中α-突觸核蛋白的沉積可引起炎癥，并可通過AS 源外泌體進(jìn)一步傳播到其他膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元[26]，導(dǎo)致疾病逐漸發(fā)展。

2 AS源外泌體的臨床應(yīng)用研究

2.1 AS源外泌體可作為CNS疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物

AS源外泌體反應(yīng)了腦內(nèi)AS的病理生理狀態(tài)，并可在多數(shù)體液如外周血、尿液、腦脊液中檢測(cè)到[27]。其脂質(zhì)雙分子層的膜結(jié)構(gòu)，也可保護(hù)其內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、核酸等免受降解[28]。因此研究者們推測(cè)AS源外泌體可能含有神經(jīng)系統(tǒng)早期病理改變的關(guān)鍵信息，并可作為一種新的生物標(biāo)志物貯存器。Hélène Ipas等[29]在研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，正常AS源外泌體中含有的2種高水平microRNA，在受膠質(zhì)瘤影響后，含量明顯下降。microRNAs是一類豐富的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，通過抑制靶基因的表達(dá)來調(diào)控各種生物學(xué)過程[30]。有人提出循環(huán)外泌體中的microRNAs可能是適合腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。因?yàn)橥饷隗w膜保護(hù)它們免受降解，這些在外泌體中傳遞的RNA生物標(biāo)記物也足夠穩(wěn)定[28,29]。與此類似，在抑郁癥、雙相情感障礙這類精神疾病中，microRNAs也是其潛在的生物標(biāo)志物之一。在壓力應(yīng)激下，AS 分泌的外泌體中存在一些microRNAs 的上調(diào)或下調(diào)[4]。這些隨病情波動(dòng)而出現(xiàn)相應(yīng)變化的microRNAs（存在于AS源外泌體中）就可以作為這些精神疾病的生物標(biāo)志物。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種漸行性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知能力的逐漸下降和記憶力的喪失。有研究發(fā)現(xiàn)，AS 分泌的富含神經(jīng)酰胺的外泌體加劇了AD相關(guān)認(rèn)知缺陷[31]。神經(jīng)酰胺是一種膜酯，由神經(jīng)鞘氨醇長(zhǎng)鏈堿基與脂肪酸組成，可在多種病理生理過程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞凋亡，同時(shí)它可隨著促炎細(xì)胞因子的升高而上調(diào)[31-33]。因此，富含神經(jīng)酰胺的AS 源外泌體可能是AD早期診斷的有力證據(jù)。

2.2 AS源外泌體可作為CNS疾病的全新治療手段

當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到病理損傷時(shí)，AS所釋放的外泌體可攜帶具有神經(jīng)保護(hù)作用的核酸、蛋白質(zhì)，靶向作用于其他神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。且AS源外泌體可有效透過血腦屏障，如果將AS源外泌體制備成藥物，就能靶向?qū)︼B內(nèi)的病灶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，從而抑制或逆轉(zhuǎn)病程的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。Kathrin Guitart 等[19]在體外培養(yǎng)建立AS 糖氧剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）的模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，AS釋放的外泌體中朊蛋白水平升高。該結(jié)果表明，當(dāng)腦組織受到缺血缺氧刺激時(shí)，AS釋放含有朊蛋白的外泌體，這些外泌體可轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元，進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)作用。Mingyang Deng等[34]則通過由H9人類胚胎干細(xì)胞分化而來的神經(jīng)元、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞和AS，進(jìn)行體外OGD 模型以研究不同人神經(jīng)細(xì)胞類型的外泌體對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。比較發(fā)現(xiàn)，AS源外泌體似乎比其他外泌體表現(xiàn)出更廣泛的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。此外，在ALS患者和ALS嚙齒動(dòng)物模型中可觀察到谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EAAT2的嚴(yán)重選擇性降低，促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的興奮毒性。有人在最典型的G93A SOD1突變型ALS小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，疾病終末期的小鼠脊髓組織中miR-124a 選擇性降低，而AS 源外泌體介導(dǎo)的外源性miR-124a 足以增加G93A SOD1突變型ALS 小鼠脊髓GLT1 蛋白的表達(dá)[17,35]。這一結(jié)果提示攜有miR-124a 的AS 源外泌體可能具有開發(fā)基于GLT1 的ALS 神經(jīng)保護(hù)策略的潛力。

3 結(jié)語與展望

AS源外泌體在神經(jīng)生理、病理學(xué)中的作用有望成為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。目前已有的研究結(jié)果表明，AS源外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中參與了許多重要的過程。正常生理?xiàng)l件下，AS源外泌體的形成和釋放可通過胞內(nèi)外鉀、鈣等離子水平進(jìn)行調(diào)控，而外泌體內(nèi)攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等是維持神經(jīng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)。病理環(huán)境下，炎癥刺激AS增加或減少外泌體的釋放，推動(dòng)或抑制CNS 疾病進(jìn)展，而AS 源外泌體內(nèi)因子水平也可隨病情發(fā)展特異性增高或降低，可作為診治鑒別疾病的重要工具及預(yù)測(cè)疾病發(fā)展變化的生物標(biāo)記物。然而，AS 源外泌體的專項(xiàng)研究仍然很少，各種研究成果尚停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的階段。因此，我們還需更全面、更深入的研究。在疾病診斷方面，需探索含特異性基因或表達(dá)蛋白的AS 源外泌體以作為生物學(xué)標(biāo)記物，如何根據(jù)外泌體中特異性因子水平的高低精準(zhǔn)判斷疾病進(jìn)展階段以及如何確保其特異性及穩(wěn)定性是需要努力的目標(biāo)；在治療方面，需探索具有特異性治療作用的AS 源外泌體以實(shí)現(xiàn)定向治療。此外，AS源外泌體作為納米級(jí)顆粒，能自由穿透血管壁、通過血腦屏障，有效避免單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，同時(shí)具有生物安全性、穩(wěn)定性、作用靶向性等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，如何將AS源外泌體修飾成治療藥物的載體、如何提高AS源外泌體的載藥量、如何進(jìn)一步修飾AS源外泌體以增強(qiáng)治療效果，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，是未來的研究方向。