miR-423-3p在乙型肝炎病毒相關肝癌肝移植組織中表達上調對患者預后的影響

柯瑞盛，陳重發(fā)，陳永泰，張思宇，劉昭暉，蔡秋程，江藝，呂立志〔.廈門大學附屬第一醫(yī)院普外科，福建 廈門600；.福建醫(yī)科大學研究生院，福建 福州50；.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門600；.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院（原南京軍區(qū)福州總醫(yī)院）肝膽外科，福建 福州5005〕

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的5年生存率較差［1］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒的慢性感染或肝硬化是HCC形成最常見的原因［2］。肝移植（liver transplantation，LT）是HCC和HBV感染的最佳治療選擇，這是LT 的最常見原因［3］。LT 術后HCC的復發(fā)是治療失敗的最重要原因［4］，但是，目前還沒有用于確定這種癌癥復發(fā)潛力的標志物［5］。miRNA 是一種長度為20 ～24個堿基的非編碼RNA，可參與轉錄后調控［6］。miRNA調節(jié)腫瘤的生物學行為，包括實體癌中的增殖、遷移和侵襲，學者已逐漸關注其在惡性腫瘤復發(fā)轉移中的作用機制［7］。研究表明，miRNA在肝癌的致癌過程中起著抑癌作用或致癌基因作用［2，8］。既往研究發(fā)現，miR-423-3p-Bim軸促進胃癌的進展并激活胃癌的致癌自噬［9］。目前對miR-423在肝細胞肝癌組織中的表達及其與肝移植患者預后的關系尚不十分清楚。本研究旨在結合生物信息學分析方法，并用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miR-423-3p在HBV-HCC組織中的表達與HBV相關肝癌肝移植患者臨床病理特征和預后關系，為腫瘤的早期干預和個性化治療提供新的防治思路。

1 資料與方法

1.1 使用StarBase V 3.0 數據庫預測分析miR-423在肝癌組織中的表達及預后價值：根據Sanger miRBase序列，miR-423 存在兩種成熟序列：即miR-423-3p和miR-423-5p［10］。我們使用StarBase V 3.0 在 線 數 據 庫［11］（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php），先對miR-423-3p和miR-423-5p在肝癌組織表達進行分析，再進一步分析了miR-423-3p和miR-423-5p表達與HCC患者預后之間的關系。根據starBase v3.0 數據庫分析結果，我們下一步再從miR-423-3p和miR-423-5p中選出本研究對象進行后續(xù)研究。再進一步分析富集miR-423靶標基因在腫瘤進展中可能參與的KEGG 通路。

1.2 組織來源：一般資料如既往研究所述［12］，從2010年1月— 2015年12 月間在聯勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院（福州總醫(yī)院）肝膽外科行肝癌肝移植手術患者中，回顧性收集治療的106例同種異體原位肝癌肝移植患者（均為HBV感染患者）的肝癌組織和正常癌旁組織（30例，取距離癌組織2 cm 處），以及患者相應臨床病理資料，使用qRT-PCR 實驗檢測肝癌樣本中miR-423-3p的表達水平。（肝癌樣本均于術中采集添加RNAlater保護液后存于-80℃超低溫）。本研究采取雙盲法，數據分析醫(yī)生不清楚肝癌樣本中miR-423-3p表達水平，實驗室人員不了解患者及臨床資料情況。本課題均獲得患者及家屬的知情同意，并于第九〇〇醫(yī)院倫理委員會處備案后得以批準實施。入組標準：① 具有HBV感染背景；② 術前未行任何抗肝腫瘤相關治療。排除標準：①術后3個月內因嚴重并發(fā)癥而死亡者；② 因非疾病因素死亡的情況。手術方法：采用原位經典肝移植（無轉流）+經下腔靜脈逆灌注。供體來源分別為心臟死亡器官捐獻供肝（25例，23.5 8%）和尸體供肝（81例，76.4 2%）。術后抗乙肝病毒復發(fā)方案和術后免疫抑制方案同本中心既往研究中所述［5，12］。

1.3 隨訪：隨訪截止時間為2017年12 月［12］。通過電話咨詢和門診復查隨訪對患者進行隨訪。定期檢查患者的血常規(guī)、肝功能、血清甲胎蛋白值、他克莫司濃度及CT、MRI影像學。詳細記錄肝移植術后患者的無瘤生存時間、復發(fā)時間、復發(fā)部位和死亡時間（月），1年內隨訪未回復的患者被視為失隨［5］。

1.4 主要試劑：Trizol 試劑、qRT-PCRSYBR Green試劑盒、逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司。寡聚核苷酸引物：目的基因miRNA-423和內參U6均由上海英駿公司設計合成，引物序列如下：PrimiRNA-423-F：5'CTACGGCGACTGTATCTTT 3'；Pri-miRNA-423-R：5'CTGTGGCTTCTCAGAACAA 3'；miR-423-3p Real-time PCR探針序列，為上海吉瑪合成，序列如下：AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAG。U6-F：5'TGCACCACCAACTGCTTAGC 3'；U6-R：5'GGCATGGACTGTGGTCATGAG 3'。

1.5 RNA提取和qRT-PCR 檢測：常規(guī)進行定量qRT-PCR。簡而言之，按Trizol 試劑說明書，提取肝組織樣品中提取總RNA，應用TaKaRa 逆轉錄試劑盒合成cDNA。為了測量miR-423-3p，根據制造商的說明，使用了Hairpin-it micro RNA和U6 snRNA 歸一化實時PCR定量試劑盒（GenePharma）?；蚨坑肔C480 實時熒光定量儀檢測，以均數±標準差（±s）來表示，實驗設置陰性對照用雙蒸水代替模板，每個樣本3個復孔，重復3次。U6小核RNA用作內部對照，比較Ct（ΔΔCt）方法確定表達倍數變化。對所使用的每種引物進行了熔解曲線分析，并且每種均顯示出一個峰，表明了所測試的每種引物的特異性［10］。此外，如前所述，針對U6對miR-423-3p的平均表達水平進行了標準化，最終數據以2-△△Ct進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析：用SPSS21.0 和GraphPad Prism5.0 軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。通過Student's t-test法分析數據。數據均以均數±標準差（±s）表示。計數資料的組間比較采用χ2檢驗和Fisher 確切概率法。應用Kaplan-Meier 法計算患者移植術后1、3、5年復發(fā)率及存活率。應用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗比較miR-423-3p高表達組和miR-423-3p低表達組的存活率差異。P ＜0.0 5表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析miR-423在肝癌組織中表達及預后價值：采用StarBase V 3.0 數據庫分析miR-423-3p和miR-423-5p在肝癌中的表達及預后價值。分析結果表明，miR-423-3p和miR-423-5p均在HCC中高表達（P ＜0.0 5，圖1A和1C）。同時，miR-423-3p高表達組HCC患者的預后較差（P ＜0.0 5，圖1B），而miR-423-5p表達與HCC患者的預后無關（P ＞0.0 5，圖1D）。綜上，miR-423-3p作為后續(xù)研究對象。

圖1 miR-423-3p和miR-423-5p 在肝癌中的表達及與預后相關性

2.2 qRT-PCR實驗miR-423-3p在HBV相關肝癌肝移植組織中的表達：qRT-PCR 檢測106例肝癌組織及30例正常肝組織中mRNA的表達水平。結果顯示，miR-423-3p在HCC組織中明顯高于正常肝組織（P ＜0.0 01，圖2）。

2.3 miR-423-3p表達與肝移植患者的臨床病理學特征關系：本研究進一步探討miR-423-3p表達與HCC患者臨床病理學特征關系，結果表明miR-423-3p表達與無腫瘤包膜、腫瘤直徑、Edmonson分級和TNM分期等密切相關（P ＜0.0 01，表1），說明了miR-423-3p可能參與HBV相關肝癌患者的疾病進展。進一步COX多因素回顧分析發(fā)現miR-423-3p表達、Edmonson 分級、TNM分期等是患者預后不良的獨立預后危險因素（P ＜0.0 5，表2、表3）。

圖2 miR-423-3p在肝癌組織和正常肝組織中的表達

2.4 miR-423-3p表達對HBV相關肝癌肝移植患者預后的影響：隨訪結果同本中心（第九〇〇醫(yī)院）既往研究所述［12］，至隨訪截止（2017年12 個月），106例肝癌肝移植患者隨訪時間為3～96個月，隨訪中位時間為35個月，5年總累積生存率為為18.8 7%（20例），隨訪期間共有50 例腫瘤復發(fā)（復發(fā)率 46.1 7%），復發(fā)時間為術后2 ～55個月，復發(fā)中位時間為14個月。復發(fā)轉移前3個主要部位依次為肺26 例（52.0 0%）、肝22 例（44.0 0%）、骨8例（16.0 0%）。

根據qRT-PCR 檢測106例肝癌肝移植組織中miR-423-3p表達水平，根據miR-423-3p表達檢測的中位表達值（4.9 60）將106例患肝癌肝移植組織標本分成miR-423-3p低表達組（53例）和miR-423-3p高表達組（53例）（圖3），結果表明miR-423-3p高表達組的肝癌肝移植患者術后預后不良（P ＜0.0 01）。應用Kaplan-Meier 法生存分析，miR-423-3p高表達組患者1、3、5年累積生存例數分別為41（77.3 6%）、15 （28.3 0%）、3（5.6 6%）；miR-423-3p低表達組患者1、3、5年累積生存例數分別為52（98.1 1%）、38 （71.7 0%）、16（30.1 8%）（表4）。經 Log-rank檢驗分析顯示，miR-423-3p高表達組的腫瘤生存率明顯低于miR-423-3p低表達組（χ2＝26.0 38，P ＜0.0 01，圖3）。

表1 miR-423-3p的表達與肝癌肝移植臨床病理學參數的相關性（例）

表2 肝癌肝移植患者總體生存的單因素分析

3 討論

肝癌的特征是易于侵犯肝臟的血管系統(tǒng)，導致復發(fā)轉移［13］。目前肝癌肝移植已占肝移植總數近40 %，肝移植手術不僅可以改善患者術后生存質量，同時移除了整個病肝，可使患者獲得治愈腫瘤可能［14］。但是對于肝癌肝移植患者而言，預防肝移植術后腫瘤復發(fā)是患者術后能否長期生存的關鍵問題之一。因此，探索生物學標志物在肝癌肝移植術前能預測復發(fā)高?；颊卟⒁試栏裾莆帐中g指征顯得尤為重要［15-16］。但是病毒性肝炎相關肝癌肝移植的診斷和預后標志物在國內外一直存在爭論。

表3 肝癌肝移植患者總體生存的多因素Cox回歸分析

圖3 兩組肝癌肝移植患者累積術后生存率的比較

在肝癌中，miRNA的一些成員已被鑒定為是參與該惡性疾病進展過程的功能分子。例如，證據表明，miR-223可以通過靶向肝細胞中的多個炎癥和致癌相關基因來改善非酒精性脂肪性肝炎和肝癌發(fā)生［17］。如miR-155是一種候選致癌miRNA，在促進HCC細胞侵襲中起重要作用，研究認為miR-155可作為一種預測肝移植術后肝癌復發(fā)的新型生物標志物［18］。因此，深入研究miRNA 在肝癌進展中的作用機制，對于改善肝癌肝移植診斷及治療具有重要意義。miR-423位于染色體17q11的頻繁擴增區(qū)域［10］。根據Sanger miRBase序列，miR-423存在兩種成熟序列：即miR-423-3p和miR-423-5p［10］。miR-423已在多種人類腫瘤疾病中有相關研究。本研究通過用StarBase V 3.0 數據庫分析結果表明，miR-423-3p和miR-423-5p均在HCC中高表達。同時，miR-423-3p的高表達與HCC患者的預后較差，而miR-423-5p的高表達與HCC患者的預后無關。故我們下一步選miR-423-3p作為后續(xù)研究對象。通過分析富集miR-423-3p靶標基因在腫瘤進展中可能參與的KEGG 通路。發(fā)現miR-423-3p靶標基因在腫瘤進展中可能通過參與MAPK 信號通路、胰島素信號通路等癌癥相關的KEGG通路，說明在腫瘤進展中miR-423-3p發(fā)揮了一定作用。本研究用qRT-PCR檢測106 例肝癌組織及30例正常肝組織中mRNA的表達水平。結果顯示在肝癌組織中miR-423-3p表達水平增高。

在胃癌中，miR-423-3p高表達可以通過降低Bim（Bcl2-Interacting Mediator of Cell Death）的表達促進胃癌進程，miR-423-3p-Bim軸可能成為胃癌中潛在的治療靶標［9］。miR-423-5p可通過抑制ING-4 表達在神經膠質瘤組織中起癌基因的作用，且有助于膠質母細胞瘤的惡性表型和替莫唑胺化學耐藥性［19］。在肝癌中的研究表明miR-423-3p通過靶向腫瘤抑制因子p21Cip1/Waf1促進肝癌細胞生長并促進細胞周期G（1）/ S過渡［10］，而miR-423-5p則沒有相應功能［10］。miR-423-3p通過調節(jié)BRMS1增強肝細胞癌的侵襲性［20］。

本研究進一步探討miR-423-3p表達與肝移植手術患者臨床病理學特征的關系，結果表明miR-423-3p表達與腫瘤包膜、腫瘤直徑、分化程度和TNM分期等密切相關，說明了miR-423-3p可能參與乙型肝炎相關肝癌患者的疾病進展。進一步COX 多因素回顧分析發(fā)現miR-423-3p表達，分化程度、TNM分期等是患者預后不良的獨立預后危險因素。進一步說明了miR-423-3p高表達可能參與了肝癌進展。本研究結果同時也提示miR-423-3p過表達肝癌肝移植患者累積生存率顯著低于低表達患者，提示肝癌組織中miR-423-3p高表達與肝移植術后患者預后不良具有相關性，說明miR-423-3p可能在肝癌發(fā)生發(fā)展及肝移植術后生存均具有一定的作用，可能作為肝癌肝移植患者中診斷和預后的候選生物標志物。

表4 肝癌患者移植術后1、3、5年累積生存率

本研究為單中心回顧性研究，研究結果需要多中心大樣本研究證實。但為miR-423-3p 在肝癌肝移植中的后續(xù)研究奠定了基礎。miR-423-3p 在肝癌復發(fā)中的分子調控機制還未明確，值得進一步研究。