海菜花浸提液對2種沉水植物的化感作用

楊棟林　陳坤平　吳荻　方軼　潘巍　侯叢林　廖文雪

摘要 以2種沉水植物密刺苦草、菹草為試驗材料，用質量濃度5 g/L的海菜花浸提液處理，到期測定因此產生的化感作用。結果表明，在質量濃度5 g/L的海菜花浸提液處理下，菹草和密刺苦草的SOD活性、POD活性和脯氨酸含量均下降，丙二醛含量顯著升高。葉綠素a、b含量也有不同程度的下降，其中，浸提液處理組菹草中葉綠素與對照組相比無顯著性差異（P>0.05），浸提液處理組密刺苦草葉綠素含量與對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。說明海菜花浸提液化感物質對密刺苦草、菹草均有脅迫作用，脅迫作用的強弱順序為密刺苦草>菹草。

關鍵詞 海菜花;菹草;密刺苦草;抗逆性;抗氧化酶;化感作用

中圖分類號 Q945文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）22-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.021

Allelopathy of Extracts from Ottelia acuminatas on Two Submerged Plants

YANG Dong-lin1，2，CHEN Kun-ping2，WU Di2 et al （1.Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education，Guilin，Guangxi 541004;2.College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541004）

Abstract The allelopathy were determined by using two kinds of submerged plants（Vallisneria natans，Potamogeton crispus） as experimental materials，and treated with the extract of Ottelia acuminata with a mass concentration of 5 g/L.The results showed that under the treatment of 5 g/L of Ottelia acuminata extract，the SOD activity，POD activity and proline content of allisneria natans and Potamogeton crispus decreased，and the MDA content increased significantly.The content of chlorophyll a and b also decreased in different degrees.The chlorophyll content in Potamogeton crispus in the extract treatment group was not significantly different from that in the control group （P>0.05），and the chlorophyll content in Vallisneria natans in the extract treatment group was significantly different from that in the control group （P<0.01）.It was shown that the liquifictive substances extracted from Ottelia acuminata had the stress effect on Vallisneria natans and Potamogeton crispus，and the order of the stress was Vallisneria natans > Potamogeton crispus.

Key words Ottelia acuminata;Potamogeton crispus;Vallisneria natans;Resistance;Antioxidant enzymes;Allelopathy

基金項目 廣西高?？茖W技術研究項目（YB2014056）;廣西師范大學教育教學改革項目（2017XJGB40）。

作者簡介 楊棟林（1971—），女，廣西玉林人，高級實驗師，碩士，從事生物化學與分子生物學實驗教學工作。*通信作者，講師，碩士，從事細胞工程與分子生物學研究。

收稿日期 2020-04-11;修回日期 2020-04-29

化感現象（allelopathy）普遍存在于植物中，是指植物在生長發(fā)育過程中，通過根系分泌、莖葉淋溶、揮發(fā)或植物殘體的腐爛降解等途徑向外界環(huán)境釋放的某些次生化學物質，對其他鄰近植物或自身造成有利的或有害的影響[1-2]。近年來，國內外學者非常關注園林植物的化感作用，已成為研究領域的熱點?？茖W合理地利用園林植物之間相互的化感作用，調節(jié)植物種間與種內相互關系，維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，調整和改善植物群落的相互配置，提高園林景觀生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展，減少維護成本，具有重要的理論和實踐的意義[3]。

沉水植物被廣泛應用于城市園林景觀建設中，但是設計師往往只用美學觀念來設計植物間的配置，而忽視了城市水生園林生態(tài)系統(tǒng)的相對封閉性，且在水生生態(tài)系統(tǒng)中，水生植物之間的化感作用更明顯，設計師忽視了植物間相克相生的生態(tài)關系，不滿足當代社會對園林建設的可持續(xù)性需求。近些年來研究沉水植物對藻類的化感作用較多，而沉水植物之間的化感作用效應相對較少[4-5]，研究如何處理好水生植物群落之間的相互關系，以便創(chuàng)造出更好的生態(tài)效益、具有可持續(xù)性強的景觀，在園林設計中具有重要意義。

海菜花（Ottelia acuminata（Gagnep.） Dandy）為多年生水鱉科沉水、漸危種，國家二級保護植物，分布于云南西北部、貴州中部、廣西西部和海南部分地區(qū)海拔2 700 m以下的湖泊濕地環(huán)境中，屬多年生草本，花期一般在5—10月，在溫暖地區(qū)全年可見開花，具有很高的觀賞、食用和凈化水質的價值[6-7]。目前，國內外學者對海菜花的研究除了大致的生境調查和少量的分類及民族學研究外，在生化水平上對其伴生物種（沉水植物）的化感作用效應鮮見報道。該研究從超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（POD）、脯氨酸、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）和葉綠素5個指標來分析海菜花浸提液對密刺苦草（Vallisneria natans）、菹草（Potamogeton crispus）的化感作用，為沉水植物在園林植物配置中提供相應的理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗于2018年1月進行，材料為海菜花、密刺苦草、菹草，3種植物均采集于廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h百壽鎮(zhèn)（生境：村莊邊的河流，砂礫質;109°44′12.00″E、3.25°06′47.99″N，海拔234 m）。選取長勢良好、個頭相當的植株，用冰桶帶回實驗室做進一步的培養(yǎng)及試驗。

1.2 方法

1.2.1 浸提液的制備。

采集生長健壯、株高25～40 cm的海菜花，蒸餾水反復沖洗干凈，全株于電熱鼓風干燥箱（GZX-9140MBE） 80 ℃干燥48 h后，用粉碎機將其粉碎。稱取20 g粉末浸泡在1 000? mL的蒸餾水中制成質量濃度為20 g/L的溶液，進行高溫（47 ℃）振蕩浸泡48 h，用孔徑為0.45 μm的醋酸纖維酯濾膜過濾，濾液用蒸餾水稀釋4倍，制成質量濃度為5 g/L的浸提液，存放到4 ℃的冰箱中備用[8]。

1.2.2 密刺苦草、菹草的培養(yǎng)。

將密刺苦草、菹草進行適應性培養(yǎng)7 d，放入300 mL的三角瓶，每瓶倒入200 mL浸提液， 每瓶1株，對照組用等體積的蒸餾水培養(yǎng)，設6個重復。培養(yǎng)箱光暗比為16 h∶8 h，溫度為25 ℃，濕度為70%，白天光照強度為4 000 lx，7 d后采樣進行各項生化指標測定。

1.2.3 過氧化物酶（POD）活性的測定。采用愈創(chuàng)木酚氧化法[9]測定，以每分鐘每克鮮質量（FW）樣品吸光度變化值變化0.01時為1個活性單位（U）。取2 g植株葉片加入適量pH 5.5的磷酸緩沖液磨成勻漿，離心（6 000? r/min，10 min，4 ℃），收集上清液，沉淀用磷酸緩沖液再提取2次，收集上清液。取上清液0.1 mL加入2.9? mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L）、1.0 mL H2O2（2%）、1 mL愈創(chuàng)木酚（1.0 mol/mL）于37 ℃水浴中保溫5 min，加入2.0 mL三氯乙酸（20%），離心（5 000 r/min，10 min，4 ℃），470 nm測吸光度，其活性計算公式如下：

POD活性=ΔA470×VTW×VS×0.01×t（1）

式中，ΔA為吸光度，VT為提取酶液總體積，W為樣品鮮重，Vs為緩沖液總體積，t為反應時間。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定。

采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[9]測定，以每分鐘每克鮮質量樣品抑制NBT光化還原的相對百分率為50%時的酶量作為1個SOD活性單位（U）的反應體系，以U/g表示[9]。

取植物葉片1 g，加pH 7.8的預冷磷酸緩沖液2 mL，冰浴研磨成勻漿，離心（4 000? r/min，20 min，4 ℃），取0.05 mL上清液加入1 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L）、0.2 mL甲硫氨酸溶液（130 mmol/L）、0.2 mL氮藍四唑（NBT）溶液（750 μmol/L）、0.2 mL EDTA-Na2溶液（100 μmol/L）、0.2 mL核黃素（20 μmol/L）、1.15 mL蒸餾水混合，總反應體系為3 mL，置于4 000 lx日光燈下反應20 min，560 nm測吸光度，其活性計算公式如下：

SOD活性=（ACK-AE）×V0.05×ACK×W×V1（2）

式中，ACK為光照對照管吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積，V1為樣品用量，W為樣品鮮重。

1.2.5 脯氨酸含量的測定[9]。

取植物葉片1 g，加5 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，冷卻后取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸、2 mL酸性茚三酮試劑，沸水浴30 min，冷卻后加入4 mL甲苯振蕩，靜置，取上層液在520 nm波長下測吸光度[9]。

1.2.6? 丙二醛（MDA）含量的測定[9]。

取植物葉片1 g，加入5 mL三氯乙酸（TCA，5%），研磨為勻漿，離心（3 000 r/min，10 min），取2 mL上清液加入2 mL硫代巴比妥酸（TBA，0.67%），沸水浴40 min，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液分別在450、532、600 nm波長下測吸光度，其濃度計算公式如下：

MDA含量=6.45（A532-A600）-0.56A450（3）

式中，A450、A532、A600分別代表450、532、600 nm波長下的吸光度。

1.2.7 葉綠素含量的測定[10]。

取植株葉片1 g，加入適量的80%的丙酮、碳酸鈣、石英砂磨成勻漿，離心（4 000 r/min，10 min），取0.5 mL上清液，加4 mL丙酮稀釋，在663 、645 nm波長處測吸光度，其濃度計算公式如下：

葉綠素a含量=12.27A663-2.69A645（4）

葉綠素b含量=22.9A645-4.68A663（5）

式中，A663、A645分別代表663和645 nm波長下的吸光度。

2 結果與分析

2.1 海菜花浸提液對2種水生植物抗氧化系統(tǒng)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是需氧生物防御過氧化損傷的活性氧（ROS）清除系統(tǒng)，SOD、POD這2種酶均屬于該系統(tǒng)的重要組成部分。在抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD是唯一能清除植物細胞內活性氧自由基（O2·-）的酶，通常被作為植物遭受外界環(huán)境脅迫情況下的檢測指標，它能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧自由基（O2·-），生成O2和H2O2，再由POD協助CAT一起催化清除H2O2，從而減少自由基對植物有機體的毒害。因此，抗氧化酶系統(tǒng)通常被認為是抵御外界逆境的防御系統(tǒng)，其酶活性的高低反映了植物在逆境條件下的生長發(fā)育狀況及代謝水平[11]。

從表1可以看出，海菜花浸提液培養(yǎng)的2種水生植物（菹草和密刺苦草）與用蒸餾水培養(yǎng)的對照組相比，SOD和POD的活性均呈顯著性下降，浸提液處理組菹草和密刺苦草的SOD活性分別為1.067和1.001 U/g，對照組SOD的活性分別為1.514和1.570 U/g，浸提液處理組與對照組相比，2種水生植物的SOD活性分別降低了41.9%（菹草）和56.8%（密刺苦草），均呈現極顯著差異（P<0.01）。浸提液處理組菹草和密刺苦草的POD活性分別為94.100和26.030 U/（g·min），對照組POD的活性分別為155.333和200.000 U/（g·min），浸提液處理組與對照組相比，2種水生植物的POD活性分別下降65.1%（菹草）和668.3%（密刺苦草），均具極顯著差異（P<0.01）。說明海菜花浸提液對這2種植物均有脅迫作用，在這2種沉水植物體中，SOD的耐受性比POD的耐受性強，與朱健等[12]的研究結果類似，在海菜花化感物質脅迫下菹草的抗氧化酶耐受性比密刺苦草強。

2.2 海菜花浸提液對2種水生植物脯氨酸含量的影響

由于脯氨酸（proline，Pro）親水性強，能穩(wěn)定植物原生質膠體及植物部分組織、系統(tǒng)的新陳代謝過程，能降低冰點，有防止植物細胞過度脫水的作用[8]。研究表明，逆境條件下，植物體內的脯氨酸含量會有所增加，是植物抵抗逆境的一種生理指標[13]。

從表2可以看出，2種水生植物（菹草和密刺苦草）對照組的脯氨酸含量顯著高于浸提液處理組，浸提液處理組及對照組菹草中脯氨酸單位鮮重的含量分別為1.841×10-3和3.264×10-3μg/mL，浸提液處理組與對照組相比脯氨酸單位鮮重含量低77.3%，具極顯著差異（P<0.01）。而浸提液處理組及對照組密刺苦草中脯氨酸單位鮮重的含量分別為1.326×10-3和2.731×10-3μg/mL，浸提液處理組比對照組低105.9%，具極顯著差異（P<0.01）。在逆境條件下，脯氨酸的合成效率降低，積累量減少，抗逆性減弱，說明海菜花分泌的化感物質對密刺苦草、菹草具有脅迫作用。

2.3 海菜花浸提液對2種水生植物丙二醛（MDA）含量的影響

植物器官在逆境條件或是代謝過程中會產生活性氧（ROS），ROS的累積會導致細胞膜脂過氧化作用[14-15]。研究表明，丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化的主要產物之一，MDA含量的高低代表著細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。

從表2可以看出，對照組植株MDA含量低于浸提液處理組的含量。海菜花浸提液處理組及對照組菹草中MDA含量分別為0.731和0.639 μmol/L，海菜花浸提液處理組與對照組相比MDA含量高12.6%，具極顯著差異（P<0.01）。浸提液處理組及對照組密刺苦草中MDA含量分別為0.760 和0.553 μmol/L，浸提液處理組MDA含量與對照組相比高27.2%，具顯著差異（0.01

2.4 海菜花浸提液對2種水生植物葉綠素的影響

葉綠素是吸收光能、轉換光能的主要物質，其含量高低體現了植物光合作用的強弱。從表3可以看出，海菜花浸提液處理組中的2種水生植物（菹草和密刺苦草）葉綠素a和葉綠素b的含量均比對照組的葉片中葉綠素a和葉綠素b含量低。海菜花浸提液處理組及對照組菹草中葉綠素a含量分別為5.058 和6.341 mg/g，兩組相比較無顯著差異（P>0.05）。海菜花浸提液處理組及對照組密刺苦草中葉綠a含量分別為2.432和5.166 mg/g，海菜花浸提液處理組與對照組相比葉綠素a含量低112.4%，具極顯著差異（P<0.01）。海菜花浸提液處理組及對照組菹草中葉綠素b含量分別為10.318和10.458 mg/g，兩組相比無顯著差異（P>0.05）。海菜花浸提液處理組及對照組密刺苦草中葉綠素b含量分別為4.844和8.985 mg/g，海菜花浸提液處理組與對照組相比葉綠素b含量低85.5%，具極顯著差異（P<0.01）。說明密刺苦草中葉綠素含量受海菜花分泌的化感物質影響較大，而菹草中葉綠素含量受海菜花分泌的化感物質影響較小。

3 討論與結論

氧在植物各代謝活動中起著重要作用，而細胞呼吸、代謝等活動會產生活性氧（ROS），在正常情況下抗氧化酶系統(tǒng)會消除過量的活性氧自由基（O2·-），使植物體內活性氧（ROS）代謝處于動態(tài)平衡。當植物遭受外界環(huán)境脅迫時，植物細胞體內O2·-會累加，引起細胞體內某些有機物損傷，從而破壞植物細胞、系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡[13]。在一定濃度范圍內，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）能清除O2·-，消除細胞體內O2·-過多造成的傷害，但當細胞體內活性氧自由基數量超過一定的閾值時，自由基則會破壞抗氧化酶[16]。因此植物遭受不良環(huán)境條件影響時，細胞內的SOD、POD會有一定程度的升高;而當外界不良影響因素加強或持續(xù)作用時，SOD或POD將受到破壞，濃度下降，即低濃度的污染物對SOD、POD有激活作用，使植物適應不良環(huán)境;而高濃度污染物對SOD、POD有毒害作用[17-18]。該試驗研究中2種受體植物的SOD、POD活性與對照組相比其濃度均明顯下降，由此可知海菜花釋放的化感物質對密刺苦草、菹草具有較強的毒害作用，其原因可能是：①受體植物體內電子傳遞鏈受阻;②膜脂過氧化，通透性改變。由于化感物質對抗氧化酶產生毒害作用，由此SOD遭受破壞，細胞內的活性氧自由基將不能還原成H2O2，細胞內的自由基大量累積，從而引發(fā)膜脂氧化作用，產出丙二醛（MDA），MDA含量越高，表明膜脂氧化程度越大，細胞膜受到傷害得越嚴重，細胞膜選擇透過性的能力將會受損，細胞外的有害物質將會進入細胞，而細胞內的物質將會大量外流，電解質進出細胞的效率加大，由此導致細胞的衰老加速[19]。該研究中試驗組菹草、密刺苦草的含量均明顯高于對照組，說明海菜花浸提液對2種沉水植物具有一定的脅迫作用。脯氨酸在鹽堿、低溫等不利的條件下，可以起到一種滲透保護作用，可作為對鹽、對水脅迫的抗逆性指標。在正?；蚴窃诃h(huán)境脅迫下，植物體內脯氨酸的合成與某種酶（P5CS）有重要關系[14]，除此之外P5CS有利于提高脯氨酸的積累，改善植物的抗逆性[15]。該試驗組中脯氨酸的含量低于對照組，而脯氨酸在逆境下其含量并未升高而是降低，其原因可能是POD、SOD遭受破壞，導致膜脂過氧化作用，生物膜系統(tǒng)受損，細胞膜選擇透過性能力下降，海菜花分泌的化感物質進入細胞內影響了P5CS的活性從而抑制了脯氨酸的合成。一般研究認為，自由基活性氧（O2·-）的產生與抗氧化酶系統(tǒng)的防御作用、膜脂過氧化作用及細胞膜的滲透作用具有密切的動態(tài)平衡關系。當活性氧增加，會誘導抗氧化酶合成，而當外界物質脅迫下活性氧驟然大量增加則導致生物膜系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，細胞膜的滲透性、選擇透過性下降，酶的活性降低[20]。葉綠素的含量與光照、溫度、pH、酶、活性氧等因素有關。該研究試驗中菹草葉綠素的含量與對照組相比無明顯差異，其原因可能是浸提液中的某些物質并未破壞菹草的葉綠體，菹草體內與葉綠素合成有關的酶沒有受到損傷。浸提液處理組中密刺苦草葉綠素的含量明顯低于對照組，其原因可能是浸提液中的某些物質破壞了葉綠體的膜結構，阻礙了光合系統(tǒng)中電子的轉移，從而降低了葉綠素的合成或與葉綠體合成有關的酶活性，導致植物合成葉綠素降低，具體原因有待進一步研究。

該研究結果表明，海菜花浸提液對密刺苦草、菹草均有脅迫作用。海菜花分泌的化感物質的脅迫作用主要通過抑制受體植物的抗氧化酶系統(tǒng)、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量來表現。在供體植物處理方式相同的情況下，不同受體植物化感效應不同[21]，而該研究表明海菜花浸提液對密刺苦草的化感作用強度高于菹草[22]，這與楊舒貽等[11]的研究結果相似。

植物之間的化感作用效應在植物群落的演替中具有重要作用，特別是在園林景觀系統(tǒng)中，沉水植物的配置應避免植物的互相克生，應該更多地考慮植物之間的化感作用，在同一園林生態(tài)系統(tǒng)中采用相互相生的植物，以保證植物群落的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，發(fā)揮景觀園林的生態(tài)環(huán)境效益和社會經濟效益，避免植物群落單一化，植物的生長發(fā)育受化感效應的抑制影響，破壞原有設計景觀，導致生態(tài)綜合效益得不到可持續(xù)發(fā)展。

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