一種三聯(lián)乳酸菌的體外降膽固醇和抗氧化能力研究

黃元霞 彭傳海 丁寧 邱忠平 李星 鄒美慧

（1. 西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031；2. 中鐵二局中心醫(yī)院，成都 610081）

膽固醇廣泛存在于人及動物體內(nèi)，是體內(nèi)組織細胞的基本活性物質(zhì)。而機體內(nèi)膽固醇過多可能會導(dǎo)致動脈脂質(zhì)沉積，引發(fā)高脂血癥，從而提高心腦血管類疾病的發(fā)病率。因此，降低血清膽固醇對于防治高脂血癥、降低心腦血管疾病的發(fā)病率具有重要的意義［1］?？墒秤萌樗峋↙actic acid bacteria，LAB）是目前公認安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等級的食品微 生物［2］，可利用菌體本身以及在腸道中分泌膽鹽水解酶（Bile salt hyelrolase，BSH）來降低血清膽固醇，從而起到防治高脂血癥的作用［2-3］。BSH可將體內(nèi)的復(fù)合膽鹽水解為游離膽鹽，促進游離膽鹽與膽固醇生成沉淀，沉淀不易被腸道吸收，會隨糞便排出體外，從而降低膽固醇含量［4］。乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)出一種天然存在的功能性、非蛋白質(zhì)氨基酸——γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），具有降血脂、降血壓等功能，可輔助治療心腦血管疾?。?］。此外，乳酸菌具有一定的抗氧化活性，可清除體內(nèi)的自由基，進而改善氧化應(yīng)激，平衡脂類代謝，減少高脂血癥的發(fā)生［6-7］。因此，乳酸菌作為一種功能性的保健食品，具有重要的開發(fā)潛力。

目前乳酸菌常常是降膽固醇和抗氧化的重要益生菌，但是多以單菌株的研究為主［8］，而對于乳酸菌制劑的降膽固醇以及抗氧化研究鮮見報道。干酪乳桿菌和哈伯氏乳桿菌具有抗氧化、降膽固醇、增強人體免疫等較多益生性能，且其效果較強，是目前市面上活菌飲料和乳制品中較常用的乳酸菌［9-10］；屎腸球菌是目前抗逆性較強的乳酸菌之一，其易在體內(nèi)定植，且仍具有較多的益生性能［11］；同時干酪乳桿菌、哈伯氏乳桿菌和屎腸球菌在發(fā)酵過程中均可產(chǎn)有機酸等代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵液的pH降低，為乳酸菌提供合適的生長條件，抑制其它有害微生物的生長，這對于延長乳酸菌制劑的保存時間具有重要的意義［10-11］。

基于上述3種乳酸菌的益生性能，本研究從西南交通大學資源微生物技術(shù)研究中心實驗室篩選保藏的若干株乳酸菌中，通過研究各菌株的益生性能，獲得有較優(yōu)降膽固醇能力和抗氧化活性的干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6，制備為三聯(lián)乳酸菌，考察其對胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性、降膽固醇能力、GABA的含量以及抗氧化活性，以期為后續(xù)研究和開發(fā)功能性微生態(tài)制劑或保健食品提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6均篩選自市售酸奶、乳酸菌飲料，由西南交通大學資源微生物技術(shù)研究中心保藏2年，且能穩(wěn)定傳代5代以上，各菌的16S rDNA在GenBank的登陸號分別為MN809276、MN809277和MN809279。金雙歧三聯(lián)活菌制劑（內(nèi)蒙古雙歧藥業(yè)有限公司）。

培養(yǎng)基以及人工胃腸液制備［12］：MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的培養(yǎng)與計數(shù)。高膽固醇培養(yǎng)基（0.1 mg/mL）用于乳酸菌降膽固醇能力檢測。人工胃液：NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%，HCl調(diào)pH為 2.5，過濾除菌備用。人工腸液：胰蛋白酶 0.10%，膽鹽0.30%，調(diào)pH至8.0，過濾除菌備用。

1.2 方法

1.2.1 三聯(lián)乳酸菌的制備 將冷凍干燥保存的供試菌株，使用前接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化菌株。利用牛津杯法對3株菌株進行拮抗實驗［13］。調(diào)節(jié)菌懸液活菌數(shù)，使得干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6的菌懸液的活菌數(shù)為2.0×109CFU/mL。然后按1∶1∶1混合得到三聯(lián)乳酸菌。將市售金雙歧活菌制劑作為對照組，按上述方法將其菌懸液活菌數(shù)調(diào)至相同。

1.2.2 人工胃腸液耐受性 將其接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，將1 mL發(fā)酵液與9 mL人工胃液混勻置37℃搖床中。然后移取1 mL處理2 h的含菌人工胃液與9 mL pH 6.8的人工腸液混合，分別在0 h、2 h、6 h、10 h、24 h取樣，按平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，按1式計算存活率［12］。

式中N1：人工胃腸液處理N個小時的活菌數(shù)；N0：0 h活菌數(shù)

1.2.3 降膽固醇能力

1.2.3.1 總降膽固醇能力 將其接種于高膽固醇MRS培養(yǎng)基中，在37℃搖床中培養(yǎng)24 h，采用硫酸鐵銨法，測定其上清液中的膽固醇濃度［14］。

1.2.3.2 BSH比活測定 采用茚三酮顯色法［15］，將其接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心用pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，之后用其調(diào)菌體濃度在OD620下值為1-2，加入25 μL、20 mmol/L的溶菌酶破壁，37℃水浴1 h。取0.1 mL上清粗酶液+1.8 mL（pH 6.0）緩沖液+0.1 mL 0.2 mmol/L的牛磺脫氧膽酸鈉溶液，37℃水浴30 min，加1.5 mL、15%三氯乙酸終止反應(yīng)，菌液離心，取1.0 mL上清液+2.0 mL茚三酮顯色液，沸水浴15 min，在OD570測定吸光值。粗酶蛋白測定：取0.1 mL粗酶上清，加水至1 mL，加入考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，在OD595測定吸光值。

酶活力定義：每分鐘每毫升酶液反應(yīng)產(chǎn)生的?；撬岬摩蘭ol數(shù)A。酶比活定義（U/mg）：酶活與每mL酶液所含的蛋白量（mg）之比。

1.2.3.3 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量的測定 參照文獻［16］的方法，將其接種于添加和不添加膽鹽的高膽固醇MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心后，測定上清液膽固醇濃度。取1 mL重懸菌液，加入20 μL、50 mmol/L溶菌酶及50 μL、10%SDS，37℃水浴1 h，然后超聲破碎，測定上清液膽固醇濃度，破壁后的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌，沉淀用1.5 mL無水乙醇重懸離心10 min，測定上清液膽固醇濃度，未破壁重懸菌液離心10 min，測定上清中膽固醇濃度。式中A：添加膽鹽及膽固醇的培養(yǎng)液上清中膽固醇含量；B：不添加膽鹽但添加膽固醇的培養(yǎng)液上清中的膽固醇含量；C：菌體洗滌液上清中膽固醇含量；D：菌體破壁后上清中膽固醇含量；E：破壁后菌泥用乙醇重懸浮后上清中的膽固醇含量；F：膽酸鹽與膽固醇共沉淀量；H：菌體吸收去除膽固醇量；I：不接種的添加膽鹽的培養(yǎng)基中膽固醇含量；J：細胞膜結(jié)合量。

1.2.3.4 BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性分析 以BSH比活（U/mg）為Y，以降解膽固醇的含量為Xi（μg/mL），其中X1代表膽固醇與膽酸鹽共沉淀的膽固醇含量（μg/mL），X2代表菌體吸收的膽固醇含量（μg/mL），X3代表細胞膜結(jié)合的膽固醇含量（μg/mL）。

1.2.4 GABA的含量 GABA標準曲線：取配置好的 1 mg/mL GABA 標準液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 于 試管中，然后分別加入蒸餾水到1.0 mL，加入0.5 mL 0.01 mol/mL 四硼酸鈉，1.0 mL 的6%苯酚入，混勻；加入 1.0 mL 次氯酸鈉溶液，混勻后靜置8 min，沸水浴 10 min，立即冰浴 5 min，加入2.0 mL的 60%乙醇，在 OD640測量其吸光度。

GABA含量測定：取1.0 mL發(fā)酵液抽濾，置于試管中，按照上述方法測量其吸光度，并通過標準曲線計算其含量［17］。

1.2.5 抗氧化活性 樣品制備［18］：對活化后的菌種培養(yǎng)液離心10 min，分別收集菌體細胞和發(fā)酵上清液；用pH為7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體細胞，再用其對菌體細胞進行重懸，再采用低溫超聲波破碎，然后離心20 min，收集上清液作為無細胞提取物。還原力：采用鐵氰化鉀還原法［18］。超氧自由基清除率：采用鄰苯三酚自氧化法［18］。羥自由基清除率：利用Fenton反應(yīng)法［18］。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次（n= 3），結(jié)果表示為x-±s，采用 SPSS22. 0統(tǒng)計軟件進行顯著性和相關(guān)性分析。P＜0. 01表示差異有統(tǒng)計學意義，誤差線用標準誤差表示。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌拮抗實驗

通過牛津杯法分別對3株乳酸菌，進行兩兩之間的拮抗實驗，其結(jié)果見圖1。

圖1 拮抗實驗

由圖1可知，兩株乳酸菌在同一平板上，兩兩之間并未存在抑菌圈，表明3株乳酸菌之間均無拮抗作用，可用于制備三聯(lián)乳酸菌。

2.2 人工胃腸耐受性

乳酸菌的人工胃腸液耐受性是其發(fā)揮益生特性的重要前提，其在不同時期的人工胃腸液中的存活率如圖2。

圖2 人工胃腸耐受性

由圖2可知，三聯(lián)乳酸菌在模擬胃腸道環(huán)境中的存活率顯著高于對照組（P＜0.01）。在人工胃液中，三聯(lián)乳酸菌存活率達86.34%以上，較對照組高29.47%；轉(zhuǎn)入腸液4 h后，三聯(lián)乳酸菌和對照組的存活率均有下降趨勢，比在人工胃液時分別下降10.69%、11.35%；轉(zhuǎn)入腸液8 h后，三聯(lián)乳酸菌的存活率較對照組高39.15%；直至24 h時，三聯(lián)乳酸菌仍處于較高水平，存活率為47.88%，其活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL，較對照組高172.2%。表明三聯(lián)乳酸菌的人工胃腸液耐受力較強。

2.3 降膽固醇能力

分別測定三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇降能力、BSH比活，利用膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜降解膽固醇的含量，分析BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性。

2.3.1 總降膽固醇能力和BSH比活 BSH可分解結(jié)合膽酸鹽，促進膽固醇與分解后的游離膽酸發(fā)生共沉淀或者在人體內(nèi)促進膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，達到去除膽固醇的目的，其大小可間接表明乳酸菌降膽固醇的能力。由此測定三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率和BSH比活，其結(jié)果見表1。

由表1可知，將三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后，三聯(lián)乳酸菌和對照組均有一定的降膽固醇能力，其膽固醇去除率分別為73.43%和58.21%。三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率較對照組高26.15%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。由此表明三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇能力較強。三聯(lián)乳酸菌和對照組都具有一定的BSH比活，且三聯(lián)乳酸菌的BSH比活顯著高于對照組（P＜0.01），其BSH比活為151.40 U/mg，較對照組高53.29%，與測定的膽固醇去除率一致。表明三聯(lián)乳酸菌的BSH比活較強，具有降膽固醇優(yōu)勢。

表1 三聯(lián)乳酸菌膽固醇去除率和BSH比活

2.3.2 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量 乳酸菌去除膽固醇主要依靠共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜，測定三聯(lián)乳酸菌的去除比例，結(jié)果見表2。

表2 三聯(lián)乳酸菌體外去除膽固醇分布

由表2可知，三聯(lián)乳酸菌對于膽固醇的去除主要靠共沉淀作用，其次為菌體吸收，只有少部分摻入細胞膜。其中利用共沉淀可去除56.46%的膽固醇，其膽固醇去除量為26.43 μg/mL；利用菌體細胞能去除39.62%以上的膽固醇，其膽固醇去除量為15.54 μg/mL；而只有3.9%的膽固醇能與細胞膜結(jié)合，其膽固醇去除量為1.83 μg/mL。表明三聯(lián)乳酸菌更易利用BSH分解結(jié)合膽酸鹽，通過共沉淀去除環(huán)境中的膽固醇。

2.3.3 BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性分析 將三聯(lián)乳酸菌的BSH比活與其共沉淀、菌體吸收以及細胞膜結(jié)合去除的膽固醇的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見表3。

表3 BSH比活與降膽固醇能力相關(guān)性分析

由表3可知，乳酸菌利用膽固醇與膽酸鹽共沉淀去除的膽固醇含量與BSH比活的相關(guān)系數(shù)r為0.898（P＜0.01），表明BSH比活與膽固醇和膽酸鹽共沉淀的含量成正比，乳酸菌利用菌體吸收和細胞膜結(jié)合的膽固醇含量與BSH酶比活的相關(guān)系數(shù)r為-0.528和-0.033（P＞0.01），表明乳酸菌菌體吸收和細胞膜結(jié)合的膽固醇含量不受BSH比活的影響。

2.4 GABA的含量

對三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后，測定發(fā)酵液中GABA的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 GABA含量

由圖3可知，三聯(lián)乳酸菌和對照組均可產(chǎn)一定的GABA。三聯(lián)乳酸菌的GABA產(chǎn)量達到1.387 mg/mL，較對照組高55.59%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。GABA含量的測定對紅曲菌的研究較多，對乳酸菌研究較少。而本研究表明三聯(lián)乳酸菌具有GABA含量，可達到一定降血脂和降血壓的作用。

2.5 抗氧化活性

以還原力、超氧自由基清除率和羥自由基清除率為抗氧化活性指標，對三聯(lián)乳酸菌的菌體細胞、發(fā)酵上清液和無細胞提取物3個部位的抗氧化性進行檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 抗氧化活性

由圖4可知，三聯(lián)乳酸菌和對照組均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其還原力和超氧自由基清除率主要存在于發(fā)酵上清液和無細胞提取物，而羥自由基清除率主要存在于菌體細胞。三聯(lián)乳酸菌總體抗氧化活性顯著高于對照組（P＜0.01）。三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力最高為1.52，較對照組高14.29%，無細胞提取物超氧自由基清除率最高為95.68%，較對照組高64.12%，菌體細胞羥自由基清除率最高為89.93%，較對照組高13.42%。因此，三聯(lián)乳酸菌具有較好的抗氧化活性。

3 討論

三聯(lián)乳酸菌有較強人工胃腸耐受能力，有利于在人體腸道內(nèi)定植。乳酸菌進入人體之后，需經(jīng)胃液的胃酸環(huán)境（pH 3.0）和胃蛋白酶，腸液的高膽鹽濃度（0.03%-0.3%）和胰蛋白酶后，定植于腸道，進而發(fā)揮其益生功能［9-10］。本研究中三聯(lián)乳酸菌在人工胃液中經(jīng)2 h后存活率達86.34%，在人工胃腸液處理24 h后，存活率為47.88%。Goldin等［19］和趙芳等［12］研究了LGG菌株在人工胃液中處理2 h的存活率分別為62.96%和69.78%，三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強的人工胃液適應(yīng)性，且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌可通過菌株間的協(xié)同作用，利用自身的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、細胞膜組成變化和維持胞內(nèi)外pH平衡等機制對酸性環(huán)境進行調(diào)劑［8-9］，進而增強在人工胃液中的存活率。其次三聯(lián)乳酸菌BSH活力較強，可提高乳酸菌的腸道黏附性，而密致細胞表層蛋白也可對抗菌物質(zhì)起到一定阻礙作用，由此三聯(lián)乳酸菌在人工胃腸液中的活菌數(shù)較高，適應(yīng)性較強［20］。

三聯(lián)乳酸菌主要利用共沉淀和菌體吸收去除膽固醇。本研究表明三聯(lián)乳酸菌的總膽固醇去除率為73.43%，產(chǎn)GABA含量為1.387 mg/mL。韋云路等［21］報道長雙歧桿菌TTF的膽固醇去除率為24.8%，印伯星等［22］發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LV108的膽固醇去除率為51.93%，表明三聯(lián)乳酸菌有較強的降膽固醇能力，且顯著高于對照組。三聯(lián)乳酸菌主要通過以下幾種機制去除膽固醇：通過共沉淀作用去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌分泌的BSH比活高達151.40 U/mg，BSH可將結(jié)合膽鹽水解生成游離膽酸，進而促進膽固醇共沉淀，因此BSH比活與膽固醇共沉淀的含量成正相關(guān)；其次游離膽酸不易被腸道吸收，干擾體內(nèi)的干腸循環(huán)，進而引起與膽固醇代謝相關(guān)受體的活性變化，最終降低腸道對膽固醇的吸收［4］。通過菌體吸收和少量摻入細胞膜去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌易在腸道內(nèi)定植，微生物數(shù)量和生理活性相對較高，通過菌體間的協(xié)同作用可提高菌體對膽固醇的吸收，從而獲得碳源和能量，而細胞膜結(jié)合少部分膽固醇后，也可能將其同化為細胞膜的組成成分［5，23］。

三聯(lián)乳酸菌有較強抗氧化活性，其還原力和超氧自由基清除主要利用無細胞提取物，而羥自由基清除主要利用菌體細胞。清除自由基可改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激，平衡體內(nèi)的脂肪代謝，避免高脂血癥的形成［7］。本研究表明三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力達到1.52，超氧自由基清除率達95.68%，發(fā)酵上清液中羥自由基清除率為85.96%。何書美等［24］研究了不同品牌酸牛奶中乳酸菌液的還原力為0.7-0.8，李曉軍等［25］篩選的發(fā)酵乳桿菌La5的超氧自由基清除率為22.29%，三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強抗氧化活性，且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌耐受能力強，微生物數(shù)量多，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)抗氧化物酶、螯合金屬離子的天然物質(zhì)以及胞外多糖等代謝產(chǎn)物含量會相對增多，進而提高還原力以及對自由基的清除能力，這對高脂血癥以及心腦血管疾病的預(yù)防有著重要的意義［26］。

4 結(jié)論

三聯(lián)乳酸菌人工胃腸耐受性較好，且降膽固醇和抗氧化活性也較強。在人工胃腸液處理24 h后，存活率為47.88%，活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL；降膽固醇能力最強為73.43%，BSH比活為151.40 U/mg，GABA的含量為1.387 mg/mL；無細胞提取物的還原力和對超氧自由基清除率最高為1.52和95.68%，菌體細胞對羥自由基清除率最高為89.93%，是一種較優(yōu)的三聯(lián)乳酸菌制劑。