堿脅迫條件下含ACC脫氨酶的根際細菌對大豆生長的影響

梁燁 何楚婷 楊悅 張玉芬 姜帆

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875）

據(jù)估計全球鹽土與堿土面積超過8.3×108hm2，這其中有一半以上是堿性土壤［1］。堿性土壤不僅含有高濃度的鹽分，同時還具有高pH值的特性，經(jīng)測定堿性土壤的pH值范圍是8.5-11［2］。在堿性土壤中生長的植物不僅受到單鹽毒害（高濃度的Na+、CO32-和HCO3-），而且還受到高pH值對植物的傷害。已發(fā)表的研究結(jié)果顯示土壤高pH值會降低土壤磷、鐵和鋅等礦質(zhì)元素的有效性［3-4］，并產(chǎn)生NH3的毒害作用［5］，打破植物體內(nèi)活性氧的平衡［6-7］，嚴重抑制了植物的光合作用以及根系的生長［8-9］。由此可見，堿性鹽對植物生長的傷害程度遠遠高于中性鹽。目前科研工作者在堿性鹽對植物的傷害機制方面已取得較好的進展［7］，但在提高植物抗堿性研究方面仍有局限。

根際促生細菌能夠通過多種作用機制促進植物生長發(fā)育，提高植物的抗逆性。例如，合成抗生素和抗真菌分子，與致病微生物競爭植物根表面的結(jié)合位點以及降解異型生物質(zhì)（如藥物、殺蟲劑等）［10］；固氮菌幫助植物獲得優(yōu)質(zhì)豐富的氮資源；分泌有機酸等物質(zhì)溶解釋放土壤中礦物磷酸鹽中的養(yǎng)分，使其轉(zhuǎn)化為植物能夠利用的可溶性礦質(zhì)營養(yǎng)，促進植物對礦質(zhì)元素的吸收和利用；誘導(dǎo)系統(tǒng)性防御機制提高植物的抗脅迫能力；直接產(chǎn)生和分泌細胞分裂素、生長素、脫落酸、赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，促進植物生長；合成ACC脫氨酶，降解乙烯合成的直接前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸），進而降低脅迫條件下植物根系中乙烯的累積量，從而增加植物的抗脅迫能力等［11-14］。

已有大量研究結(jié)果表明含ACC脫氨酶的根際促生細菌能提高植物對重金屬、干旱、中性鹽以及洪澇等非生物脅迫的抗逆性［15］，但是關(guān)于其提高植物抗堿性的研究卻很有限。ACC脫氨酶可以將乙烯合成的直接前體ACC降解為氨和α-酮丁酸，作為細菌生存的氮源和碳源［16］，在這個酶的催化作用下，植物組織中ACC的含量降低，乙烯的合成量便會減少。脅迫條件下迅速積累的高濃度乙烯是抑制植物生長的主要原因［16］。高pH值會導(dǎo)致植物體內(nèi)乙烯及其合成前體ACC含量升高［17］，那么接種含ACC脫氨酶的根際細菌是否能通過降低乙烯的含量來提高植物的耐堿性仍未知。

大豆是我國重要的經(jīng)濟作物，土壤堿化嚴重威脅著大豆生產(chǎn)。近幾年，科研工作者從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的層面細致地研究了大豆耐中性鹽的機制［18-20］。但是關(guān)于大豆耐堿性的研究卻比較有限，目前獲得的比較有價值的發(fā)現(xiàn)是野生大豆比栽培型大豆耐堿［20］，研究人員將野生大豆中的耐堿相關(guān)基因轉(zhuǎn)到擬南芥或苜蓿中，以期提高植物的耐堿性［21-23］，但是類似的研究結(jié)果在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用價值有限。

根際促生細菌Variovorax paradoxus5C-2含有ACC脫氨酶，它具有良好的抗?jié)B透壓性、抗逆性和較強的競爭力［24-26］。V. paradoxus菌株的泛基因組和核心基因組在功能上與植物代謝的多樣性和促進生長的性狀有關(guān)［27］。已有實驗探明V. paradoxus5C-2存活的環(huán)境條件：最適溫度是28℃，存活溫度范圍是15-37℃，土壤pH的范圍是5-9，土壤滲透勢范圍是-12 MPa到-0.14 MPa。它在田間土壤中能顯著提高植物的抗旱性［28］。本實驗室的前期研究結(jié)果顯示，該菌能促進豌豆對礦質(zhì)元素的吸收［29］，并且能提高豌豆的抗鹽性［30］。而接種該菌能否提高大豆的耐堿性還未知。本論文將研究堿脅迫條件下，接種根際細菌V. paradoxus5C-2對大豆生長、光合作用和根系構(gòu)型的影響，以期為提高作物的耐堿性提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

含ACC脫氨酶的PGPR菌株Variovorax paradoxus5C-2，從俄羅斯農(nóng)業(yè)微生物保藏中心（St Petersburg，Russian Federation）獲得。試驗所用大豆（Glycine max（L）.Merr.）為中黃13大豆，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將Variovorax paradoxus5C-2接種于Bacto-PseudomonasF（BPF）培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，選取生長良好的單菌落接種于50 mL BPF液體培養(yǎng)基中，放入搖床中（250 r/min，28℃過夜），富集培養(yǎng)至細菌的對數(shù)生長期。稀釋菌懸液，將菌懸液濃度調(diào)整至108CFU/mL即用分光光度計在波長540 nm處測得的OD值為0.537。接菌時，將4 mL菌液澆于每株大豆莖基部，然后用少量營養(yǎng)液沖下，使菌液到達根系周圍。BPF固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉，10；胰蛋白胨，10；K2HPO4，1.5；MgSO4，1.5；Agar，16。BPF液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉，10；胰蛋白胨，10；K2HPO4，1.5；MgSO4，1.5。

1.2.2 大豆的培養(yǎng) 選取顆粒飽滿、大小近似的大豆種子，用10%的過氧化氫溶液浸泡消毒10 min，之后用去離子水沖洗干凈，播種于裝有滅過菌的干凈石英砂的塑料花盆中，覆蓋黑色塑料布以遮光，在溫室中培養(yǎng)。待種子發(fā)芽時，揭開黑塑料布。種子萌發(fā)期間，每日適時適量補水。大豆幼苗長出第一對復(fù)葉后，選取長勢相同，主根完整的幼苗移入盛有滅過菌的石英砂的花盆中，花盆體積大約是2.5 L。移苗后第2天，澆灌1/4 Hogland營養(yǎng)液。3 d后，澆灌1/2 Hogland營養(yǎng)液，再過3 d，澆灌全營養(yǎng)液。

Hogland營養(yǎng) 液 組 成 如 下（單 位：μmol/L）：KNO3，2 800；Ca（NO3）2·4H2O，1 600；MgSO4·7H2O，1 000；NH4NO3，2 000；NaH2PO4，600；Na-FeEDTA，40；H3BO3，10；ZnSO4，2；MnSO4·4H2O，2；CuSO4·5H2O，0.5；Co（NO3）2·6H2O，0.2；H2MoO4，0.08。

1.2.3 加菌和鹽堿處理 移苗后第16天，開始接菌處理。將大豆幼苗分為2組，其中一組加菌，另一組不加菌，加菌組每4 d進行一次，每次加4 mL濃度為108CFU/mL菌液，處理時間持續(xù)16 d。將加菌組和不加菌的大豆植株在組內(nèi)分別分成4組，每組4-7個植株，之后進行以下處理（表1）。具體的分組處理為：澆灌完全營養(yǎng)液的對照組（pH為6.02）；含40 mmol/L NaCl的營養(yǎng) 液（pH為6.03）；含40 mmol/L鈉離子的NaHCO3的營養(yǎng)液（pH為8.12）；含40 mmol/L鈉離子并且Na2CO3與NaHCO3以1∶15混合的營養(yǎng)液（pH為9.04）。每2 d用充足的、相應(yīng)處理的營養(yǎng)液澆灌大豆植株，直到有液體從盆子下部的小孔中流出。鹽堿處理開始時間和結(jié)束時間與接菌處理一致。

1.2.4 生理指標(biāo)的測定 測定生物量：大豆移苗后32 d，即鹽堿處理以及接菌16 d后，將大豆植株分為地上部和根系，稱量鮮重后，用烘箱將植株水分烘干至質(zhì)量不再變化，稱量其干重。

測定大豆主根長度和側(cè)根總根長：在每個處理組中隨機選取3株大豆根系，將其鋪展開后，用尺子測量主根及側(cè)根的長度，之后計算側(cè)根的總長度。

測定氣孔阻力：采用AP4型氣孔計，移苗后第30天在9：00-11：00測定植株葉片的氣孔阻力，測定部位為第5對三出復(fù)葉。

表1 實驗處理方案

測定光合指標(biāo)：采用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMINI-PAM（德國，WALZ）及WinControl-3.2軟件，移苗第32天在19：00-21：00間，測定植株葉片的光合作用熒光參數(shù)——初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm），計算可變熒光Fv（Fv=Fm-Fo）和光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ complex，PSⅡcomplex）原初光能最大轉(zhuǎn)換效率（Fv∶Fm）。測定部位為大豆第4對三出復(fù)葉。

測定葉綠素含量：移苗后第31天，即鹽堿處理和接菌處理15 d，取大豆植株的第五對復(fù)葉，將葉片洗凈，用吸水紙吸干表面水分，去大葉脈后，剪碎葉片，用于測定葉綠素的含量，測定方法詳見《植物生物學(xué)實驗指導(dǎo)》［31］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Office Excel 2016和GraphPad Prism 6.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，對不同鹽堿處理的小組中的接菌組、未接菌組進行統(tǒng)計分析及2個獨立樣本t-檢驗，對不同處理的小組進行組間單因素方差分析比較。其中顯著性檢驗P值為0.05。

2 結(jié)果

2.1 鹽堿處理條件下，接種根際促生細菌V.paradoxus 5C-2對大豆干重的影響

中性鹽（NaCl）和堿性鹽（NaHCO3和Na2CO3）中鈉離子的濃度都是40 mmol/L，分別處理大豆后發(fā)現(xiàn)，與對照植株相比中性鹽對大豆地上部生物量沒有影響，但是堿性鹽對地上部生物量的抑制效應(yīng)卻非常顯著，在pH為8.12和9.04的條件下分別降低了39%和51%。接種根際細菌V. paradoxus5C-2后，對照組、中性鹽處理和堿性鹽處理的大豆地上部生物量分別增加了15%、8%、19%和27%。在pH值是9.04的條件下，根際細菌促進地上部干重增長的比例最大（圖1-A）。

中性鹽處理導(dǎo)致大豆根系干重增加了15%，然而堿性鹽（pH分別為8.12和9.04）處理卻使根系干重降低了31%和37%。接種V. paradoxus5C-2后，對照組、中性鹽處理和堿性鹽處理的大豆根系干重分別增加了18%、14%、21%和31%。在pH值是9.04的條件下，根際細菌促進根系干重增長的比例最大（圖1-B）。

中性鹽和堿性鹽處理以及根際細菌對大豆整個植株干重的影響與對地上部干重的影響一致。雙因素方差分析結(jié)果還表明，鹽堿處理與細菌接種處理對植物生物量的影響之間沒有明顯的交互作用（P＞0.05），即V. paradoxus5C-2 改善植物生長的效應(yīng)和鹽堿處理抑制植物生長的效應(yīng)是相互獨立的。

2.2 鹽堿處理條件下，接種根際促生細菌V.paradoxus 5C-2對大豆根系構(gòu)型的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明，與對照相比，中性鹽處理的大豆側(cè)根總長度沒有明顯變化，但是堿性鹽處理時大豆側(cè)根總長度顯著降低，分別降低了36%和57%。接菌處理后，對照組大豆根系側(cè)根總長度顯著升高。中性鹽和堿性鹽處理的植株接菌處理后，側(cè)根總長度分別提高了12%、36%和17%（圖2-A）。

雙因素方差分析結(jié)果表明，鹽堿處理以及接菌處理對大豆主根長度均未產(chǎn)生顯著性影響，但是從數(shù)值上來看，堿性鹽處理導(dǎo)致主根長度降低了13%和18%。加菌處理后，對照組、中性鹽處理和堿性鹽處理的大豆主根長度分別增加了11%、7%、11%和18%（圖2-B）。

雙因素方差分析結(jié)果還表明，鹽堿處理與細菌接種處理對植物根系構(gòu)型的影響之間沒有明顯的交互作用（P＞0.05），即V. paradoxus5C-2 對植物根系構(gòu)型的影響和鹽堿處理對根系構(gòu)型的負面效應(yīng)是相互獨立的。

2.3 鹽堿處理條件下，接種根際促生細菌V.paradoxus 5C-2對大豆葉片氣孔阻力的影響

圖1 鹽堿和接菌處理16 d（移苗32 d），大豆地上部（A）、根系（B）以及整個植株的干重（C）

雙因素方差分析結(jié)果表明，堿性鹽脅迫處理和接種細菌處理都會顯著影響大豆的氣孔阻力。如圖3所示，未接菌時，含40 mmol/L鈉離子的中性鹽對大豆氣孔阻力沒有影響，但是含40 mmol/L鈉離子的堿性鹽處理卻顯著提高了氣孔阻力，在pH值分別是8.12和9.04的條件下，氣孔阻力分別升高了176%和209%。接菌處理后，對照組和中性鹽處理的大豆葉片氣孔阻力沒有明顯變化，但是堿性鹽處理的大豆氣孔阻力卻出現(xiàn)顯著降低，分別降低了25%和16%。

圖2 鹽堿和接菌處理16 d（移苗32 d），大豆側(cè)根總長度（A）和主根長度（B）

雙因素方差分析結(jié)果還表明，鹽堿處理與細菌接種處理對植物氣孔阻力的影響之間沒有明顯的交互作用（P＞0.05），即V. paradoxus5C-2 對植物氣孔阻力的影響和鹽堿處理的效應(yīng)是相互獨立的。

2.4 鹽堿處理條件下，接種根際促生細菌V.paradoxus 5C-2對大豆葉綠素含量的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明，鹽堿處理會顯著影響大豆完全展開葉片中葉綠素a的含量。當(dāng)用中性鹽處理時，大豆第5對三出復(fù)葉中葉綠素a的含量顯著高于對照組，但是堿性鹽處理的大豆葉綠素a的含量顯著低于對照，分別降低了55%和71%。接菌處理導(dǎo)致對照組、中性鹽處理和堿性鹽處理的大豆葉片中葉綠素a含量有升高的趨勢，分別提高了30%、21%、23%和89%（圖4-A）。

圖3 鹽堿和接菌處理14 d（移苗30 d），大豆第五對復(fù)葉葉片的氣孔阻力

堿性鹽處理會顯著影響大豆完全展開葉片中葉綠素b的含量。未接菌時，中性鹽處理的大豆葉片中葉綠素b的含量增加了64%，但是堿性鹽處理的大豆葉綠素b的含量卻顯著降低，分別降低了55%和71%。在各種鹽堿處理條件下，接菌處理都提高了大豆葉綠素b的含量。接種V. paradoxus5C-2后，對照組、中性鹽處理和兩種堿性鹽處理的大豆葉片中葉綠素b含量分別升高了31%、22%、25%和87%（圖4-B）。鹽堿處理和接菌處理后大豆葉片中總?cè)~綠素含量的變化趨勢與葉綠素a和葉綠素b相似。

分析結(jié)果還表明，鹽堿處理與細菌接種處理對葉綠素含量的影響之間沒有明顯的交互作用（P＞0.05），即V. paradoxus5C-2 對葉綠素含量的影響和鹽堿處理的效應(yīng)是相互獨立的。

2.5 鹽堿處理條件下，接種根際促生細菌V.paradoxus 5C-2對大豆光合效率的影響

Fv/Fm 的數(shù)值代表暗適應(yīng)葉片的原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)量，它能衡量葉綠體進行光合作用的最大潛能。中性鹽導(dǎo)致光系統(tǒng)的最大光合潛能（Fv/Fm）顯著升高，但是堿性鹽處理使Fv/Fm分別降低了23%和39%，而接菌處理可以提高 Fv/Fm，且這種提高效應(yīng)在pH值是9.04時是顯著的。對照組、中性鹽處理和兩種堿性鹽處理的大豆接種細菌后 Fv/Fm分別提高了3%、2%、5%和23%（圖5）。

鹽堿處理與細菌接種處理對Fv/Fm的影響之間沒有明顯的交互作用（P＞0.05），即V. paradoxus5C-2 對Fv/Fm的影響和鹽堿處理的效應(yīng)是相互獨立的。

圖4 鹽堿和接菌處理15 d（移苗31 d），大豆第五對復(fù)葉的葉綠素a（A）、葉綠素b（B）以及總?cè)~綠素含量（C）

3 討論

圖5 鹽堿和接菌處理16 d（移苗32 d），大豆第4對三出復(fù)葉的最大光合潛能。

中性鹽與堿性鹽的相似之處在于都含有Na+，而不同之處是中性鹽主要以NaCl和Na2SO4的形式存在，而堿性鹽主要以NaHCO3和Na2CO3的形式存在。為了排除Na+的作用效應(yīng)，更好地探究堿性（高pH值）對大豆生長發(fā)育的影響以及根際促生細菌V. paradoxus5C-2在高pH值條件下對大豆的作用效果，我們對實驗方案做了以下設(shè)定：即40 mmol/L NaCl、含有40 mmol/L Na+的堿性鹽NaHCO3以及Na2CO3與NaHCO3以1∶15的比例混合。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，40 mmol/L NaCl處理的大豆地上部和根系的干重沒有顯著變化，但是葉綠素a的含量和最大光合潛能（Fv/Fm）都顯著升高，這說明中黃13大豆具有一定的耐中性鹽的能力。當(dāng)用含40 mmol/L Na+的堿性鹽（pH值分別為8.12和9.04）處理16 d后，大豆地上部的生物量顯著降低，根系干重也大幅減少，分別降低了31%和37%，側(cè)根總長度、葉綠素含量以及光合效率也都降低，氣孔阻力顯著升高，這些實驗結(jié)果表明高pH值嚴重抑制了大豆的生長，這與已發(fā)表的研究結(jié)果一致［7-9］。

接種含ACC脫氨酶的根際促生細菌V. paradoxus5C-2后，在各種鹽堿處理條件下，大豆地上部和根系的干重均增加，而且增加的幅度隨著脅迫程度的加劇而明顯增大。在堿脅迫條件下，尤其在pH值是9.04時，接菌處理后大豆的側(cè)根總長度、葉綠素含量以及最大光合潛能均明顯升高，氣孔阻力急劇下降，這些實驗結(jié)果表明在高pH值條件下接種根際細菌V. paradoxus5C-2能明顯緩解堿對大豆的脅迫效應(yīng)。

當(dāng)植物遭受堿脅迫時，植物根系的生長顯著降低［7-9］，這與本實驗結(jié)果相一致。高pH值通常會導(dǎo)致植物體內(nèi)乙烯及其前體ACC含量升高［10］。施用乙烯合成前體ACC可以迅速降低擬南芥根尖細胞的分裂速率［32-33］，抑制根系的伸長生長［9］。這些實驗證據(jù)表明，堿脅迫時植物體內(nèi)增加的乙烯和ACC在根細胞伸長生長和細胞分裂過程中都起著負調(diào)控的作用。接種V. paradoxus5C-2后，大豆根組織中乙烯濃度可能降低，從而緩解了高pH對根系生長的抑制效應(yīng)。

葉綠素是綠色植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，在光合作用中起捕獲和傳遞能量的作用［34］。葉綠素的含量與植物的光合效率密切相關(guān)。當(dāng)植物體遭受干旱、高溫等非生物脅迫時，乙烯含量的累積會誘導(dǎo)葉綠素降解，促進葉片的衰老和脫落。外源施加乙烯生物合成抑制劑AVG或乙烯感知抑制劑1-MCP能夠延緩燕麥（Avena sativa）、小麥（Triticum aestivum）、棉花（Gossypium hirsutumL.）和匍莖剪股穎（Agostis stolonifera）等植株葉片在高溫和干旱脅迫下的衰老，并增加葉片中葉綠素的含量［35-37］。由此可知，降低乙烯在植物體中的累積量將緩解葉綠素的降解過程，增加葉綠素的含量［38］。乙烯能顯著提高柑橘果皮中葉綠素降解相關(guān)基因CitNYC和CitChlase的表達量，從而導(dǎo)致葉綠素含量的降低。CitERF13是乙烯響應(yīng)過程中轉(zhuǎn)錄因子ERF基因中的一種，被證明是CitPPH啟動子潛在的直接調(diào)控物，在柑橘（Citrus sinensis）、番茄（Solanum lycopersicum）和煙草（Nicotiana）等植物的葉綠素降解過程中起重要的作用［39］。接菌V.paradoxus5C-2可能降低了大豆組織中乙烯的含量，從而阻止葉綠素降解過程中相關(guān)酶基因的表達，減緩葉綠素的降解速率。

氣孔是植物與外界交換氣體的窗口。植物以向外界散失水分為代價來獲取CO2，以滿足光合碳固定所需。研究發(fā)現(xiàn)中性鹽脅迫導(dǎo)致豌豆（Pisum sativum）氣孔阻力增加，但是接種V.paradoxus5C-2后，氣孔阻力數(shù)值降低［30］。本實驗中，當(dāng)大豆遭遇堿脅迫時，氣孔阻力的數(shù)值顯著升高，但是接菌后氣孔阻力明顯降低，這意味著氣孔開度比未接菌的大豆更大，有利于葉肉細胞與外界進行氣體交換以獲得更多的 CO2用于光合作用的碳同化。對于C3植物，進入葉肉細胞中CO2的量是限制植物光合效率的主要因素。

由以上實驗結(jié)果可知，根際促生細菌V.paradoxus5C-2可能通過調(diào)控多個生理過程來緩解高pH值對大豆的傷害。這種細菌促進大豆側(cè)根和主根的生長，改變植物根系構(gòu)型，而且還有研究結(jié)果顯示接種含ACC脫氨酶的根際細菌能提高大豆的根系導(dǎo)水率［40］，因為它使根系中乙烯的合成量降低，削弱了乙烯對水通道蛋白活性的抑制作用，從而提高根系的導(dǎo)水率［41］。根系生長和根系構(gòu)型的改善以及根系導(dǎo)水率的提高最終改善了大豆的水分關(guān)系，使得氣孔阻力降低，植物獲得了更多的CO2。與此同時，乙烯含量的降低還減緩了葉綠素的降解過程，從而使植物在堿脅迫的條件下保持一定的光合能力。

在這些實驗基礎(chǔ)之上，未來我們還需從生理和分子的層面進行深入研究，具體分析V. paradoxus5C-2通過調(diào)控哪些基因的表達來改變根系構(gòu)型，這種細菌對葉綠素降解過程中關(guān)鍵酶基因表達模式的調(diào)控作用，以及對其他激素合成與降解的影響，以期為提高植物的耐堿性提供一種環(huán)保有效的策略。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明含40 mmol/L Na+的中性鹽對大豆沒有抑制作用，但是堿性鹽卻導(dǎo)致大豆生長顯著降低。接種含ACC脫氨酶的根際細菌V.paradoxus5C-2能提高植物在堿脅迫條件下的生長，并且在較高pH值條件下其作用效果更明顯，表明此類細菌可以緩解堿性鹽對大豆的脅迫效應(yīng)。