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    基于轉(zhuǎn)錄組測序花煙草響應(yīng)鹽脅迫活性氧清除相關(guān)基因的挖掘

    2020-12-21 09:19:40魯琳楊尚諭劉維東魯黎明
    生物技術(shù)通報 2020年12期
    關(guān)鍵詞:谷胱甘肽活性氧煙草

    魯琳 楊尚諭 劉維東 魯黎明

    (1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,成都 611130;2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,成都 611130)

    土壤鹽漬化是威脅植物正常生長的最重要因素之一,并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅[1]。在高鹽脅迫下,Na+所產(chǎn)生的滲透脅迫和離子毒性嚴重影響了植物細胞代謝和生理功能,阻礙植物生長和發(fā)育,嚴重時會導(dǎo)致植物的死亡[2]。在長期的進化過程中,植物形成了一套復(fù)雜的抵御鹽脅迫的機制。在鹽脅迫下,植物通過活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游基因表達,以及啟動過度鹽敏性 (Salt overly sensitive,SOS)途徑等來調(diào)節(jié)其形態(tài)、生理和生化過程,以抵御外界高鹽的環(huán)境[3]。在這些機制中,ROS清除系統(tǒng)在植物對鹽脅迫的適應(yīng)中起著重要的作用。

    植物在高鹽、干旱、寒冷、高溫和遭受病原菌的侵染時,均會產(chǎn)生大量的ROS,而過量的ROS,會被植物細胞的抗氧化防御系統(tǒng)所清除[4]。研究表明,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、過氧化氫酶(Catalases,CAT)、抗壞血酸過氧化物 酶(Ascorbate peroxidase,APX)、愈 創(chuàng) 木 酚 過氧化物酶(Guaiacol peroxidase,GPOX)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(Monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)等,是植物活性氧清除的關(guān)鍵酶與主要執(zhí)行者[4]。研究表明,在鹽脅迫下,煙草幼苗的SOD、POD、CAT及APX的活性均有所增強[5-6]。同時,SbpAPX在煙草中的過表達,增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽及干旱的抵抗能力[7]。Cu/Zn-SOD[8-9]、Mn SOD[10-11]、POD[12]、CAT[13]、APX[14-15]及GPX[16-17]的過表達植株,均表現(xiàn)出較高的對鹽脅迫的耐受能力。

    轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物生命活動調(diào)節(jié)的重要調(diào)控形式,轉(zhuǎn)錄組測序則是了解植物基因總體表達情況的強大工具。目前,高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫的機制研究中得到了廣泛的應(yīng)用[18-20],一大批涉及防御、物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝的基因得到鑒定,對于揭示植物抗逆的分子機制起到了很大的推動作用。

    花煙草(Nicotiana alata)是屬于茄科煙草屬的一年生野生草本植物,由于其花色艷麗多樣、花期較長,在園林綠化中得到了較多的應(yīng)用。然而,土壤鹽漬化也嚴重影響了花煙草的正常生長。目前,對花煙草鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究尚不多見。

    本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù),分析花煙草響應(yīng)鹽脅迫的基因的表達特性,重點挖掘與分析了ROS清除的相關(guān)基因,以期為花煙草耐鹽的分子機制的研究,以及耐鹽花煙草品種的選育提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    以花煙草(Nicotiana alata)為試驗材料,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草實驗室提供。

    1.2 方法

    1.2.1 材料處理及轉(zhuǎn)錄組測序 幼苗材料培養(yǎng):挑選籽粒飽滿且大小一致的種子,用次氯酸鈉溶液表面消毒后,用無菌水清洗數(shù)次,隨后播種于MS培養(yǎng)基上,并置于恒溫培養(yǎng)室中生長(光照:16 h光/8 h暗;溫度:25℃)。

    鹽脅迫處理及總RNA提?。捍裏熋缟L4周后,挑選36株長勢一致的煙苗,分為3組,每組煙苗為1個重復(fù),每重復(fù)12株煙苗。在無菌操作臺中,將其分別移苗至含有200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上,然后,繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)(光照:16 h光/8 h暗;溫度:25℃)。在處理0 h和12 h后,按重復(fù)進行整株取樣,并置于液氮中保存,用于總RNA的提取。參照魯黎明等[21]方法提取總RNA,并經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送北京諾禾致源科技公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

    1.2.2 測序數(shù)據(jù)的分析及功能注釋 對測序所獲得的原始數(shù)據(jù),按照諾禾致源公司的數(shù)據(jù)處理方法,進行原始數(shù)據(jù)的過濾,獲得高質(zhì)量的clean reads,并進行后續(xù)分析。采用BLAST軟件,在NCBI的non-redundant(NR)、UniProt/ Swiss-Prot、Gene Ontology(GO)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes)等數(shù)據(jù)庫進行比對,并進行差異基因的功能注釋、GO及KEGG分析。

    差異基因(Differentially expressed genes,DEGs)的篩選條件為P-value≤0.01,| log2Fold Changes|≥1。其中,F(xiàn)old Changes代表不同處理之間基因表達量的比值。該值大于1時,則該基因認定為上調(diào)表達;反之,則為下調(diào)表達。

    1.2.3 差異表達基因的驗證 為了對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進行驗證,隨機挑選8個基因,并利用Primer 5.0軟件設(shè)計擴增引物(表1),采用qPCR的方法,對其表達水平進行驗證。將各處理的樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板,進行qPCR反應(yīng),內(nèi)參為β-actin。qPCR的反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及基因相對表達量的計算均參照魯黎明等[21]方法進行。

    表1 qPCR反應(yīng)所用引物

    2 結(jié)果

    2.1 測序質(zhì)量分析

    采用高通量測序平臺,對低溫處理組及對照組的樣品進行了RNA測序。結(jié)果顯示,共獲得47 599 094-62 591 696 clean reads(表2)。就每個樣品的GC含量來看,其含量為42.97%-43.19%,偏差很小,而且基本呈隨機分布,且Q30的數(shù)值均大于90%,說明本次測序的質(zhì)量非常可靠。

    表2 各樣品測序質(zhì)量

    通過對樣品重復(fù)間數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析,結(jié)果(圖1)表明,重復(fù)之間的決定系數(shù)R2最低為0.962,最高則達到了0.978,說明重復(fù)之間數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好,可用于下一步的分析。

    2.2 差異表達基因統(tǒng)計分析

    將鹽脅迫處理12 h與0 h樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比分析,以|log2fold changes|≥1,以及P-value≤0.01為篩選條件,篩選差異表達基因。結(jié)果表明,高鹽(200 mmol/L NaCl)處理12 h后,差異表達基因的數(shù)量達到了7 239個,其中,上調(diào)表達基因4 077個,下調(diào)表達基因3 162個。

    2.3 差異表達基因的GO功能注釋分析

    對差異基因所進行的GO分析結(jié)果顯示,上調(diào)差異表達基因的功能主要集中于生物過程(Biological process)、細胞組分(Cell component)以及分子功能(Molecular function)方面。在生物過程中,差異表達基因所富集的GO的數(shù)目達108個;細胞組分以及分子功能則分別富集到7和32個GO條目(P-value≤0.01)。下調(diào)差異表達基因富集到12個GO條目,涉及到生物過程及分子功能2個部分。

    2.3.1 上調(diào)差異表達基因富集的GO 在上調(diào)差異表達基因所富集的108個GO中,差異表達基因數(shù)量超過500個的有19個GO條目。其中,Biological process最大,包括差異表達基因4 585個(76.97%),其次為Metabolic process,包括3 660個差異表達基因(61.31%)。富集上調(diào)表達基因數(shù)目較多的屬于Biological process的前30個GO條目的具體信息見表3。

    圖1 樣品各重復(fù)之間的相關(guān)性分析

    富集到Cell component部分的差異表達基因,可以歸為7個GO條目,分別為Membrane(1 747,29.26%)、Photosystem(94,1.57%)、Oxidoreductase complex(48,0.80%)、Photosystem I(30,0.50%)、Chloroplast(29,0.49%)、Plastid(29,0.49%) 和Photosystem II oxygen evolving complex(25,0.42%)。其中,有48個上調(diào)差異表達基因與氧化還原酶蛋白復(fù)合體的形成有關(guān)。

    在分子功能方面,上調(diào)差異表達基因富集到32個GO條目,其中,催化活性(Catalytic activity)基因數(shù)目最多(3 314,55.51%),其次為氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)基因(852,14.27%)(表4)。值得注意的是,參與氧化還原酶活性的差異基因達1 520個,占比25.46%。

    2.3.2 下調(diào)差異表達基因富集的GO 鹽脅迫下,煙草顯著下調(diào)表達的基因主要富集在生物過程(Biological process)與分子功能(Molecular function)(表5)。前者包括5個GO條目,290個基因;后者則含有7個GO條目,270個基因。生物過程的5個GO條目,全部與離子的轉(zhuǎn)運有關(guān);分子功能的GO條目包括離子轉(zhuǎn)運活性及氧化還原活性兩類。此結(jié)果顯示,花煙草在遭受高鹽逆境時,其顯著下調(diào)表達基因的數(shù)目及富集到的GO數(shù)目,均遠遠低于上調(diào)基因。說明花煙草在響應(yīng)高鹽脅迫時,是以上調(diào)表達基因所參與的生理過程為主,同時也暗示,其離子轉(zhuǎn)運及氧化還原的生理過程可能發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用。

    2.4 差異表達基因的KEGG通路分析

    通過對差異表達基因進行KEGG通路分析(圖2)。上調(diào)差異表達基因顯著富集到7條主要的代謝通路(q value ≤0.05)。富集因子最高的為Glycerolipid metabolism途徑,其次為Glycolysis/ Gluconeogenesis和Carbon fixation in photosynthetic organisms途徑。而富集差異基因最多的途徑為Biosynthesis of secondary metabolites,富集到543個差異表達基因,其次為Carbon metabolism途徑,有162個差異表達基因被富集到該途徑。

    表3 上調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析(生物過程)

    下調(diào)差異表達基因顯著富集的通路數(shù)量只有5條(q value≤0.05),其中,富集因子最高的通路為Circadian rhythm-plant。在富集基因的數(shù)量方面,這5條通路所富集差異表達基因的數(shù)量,較上調(diào)基因少了很多。富集下調(diào)差異基因最多的通路為Pyrimidine metabolism,僅僅富集了58個基因。其次,為Ribosome biogenesis in eukaryotes途徑,富集的差異表達基因數(shù)為57個。

    從富集差異表達基因的代謝途徑數(shù)量的角度也可以看出,高鹽處理后,花煙草代謝途徑中,上調(diào)基因富集的代謝途徑數(shù)量遠遠高于下調(diào)基因。從而在某種程度上說明,花煙草在遭受高鹽脅迫后,其生理響應(yīng)過程主要以上調(diào)相關(guān)基因的表達為主。

    2.5 花煙草響應(yīng)高鹽脅迫的抗氧化基因分析

    植物在遭受高鹽、干旱等非生物及生物脅迫時,均會產(chǎn)生ROS,過量的ROS會對細胞的正常生命活動造成阻遏。因此,細胞會動員其抗氧化系統(tǒng)來清除這些ROS。為了探索花煙草抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達對高鹽脅迫的響應(yīng),分析了差異表達基因中SOD、POD、CAT等7類ROS清除基因的表達。結(jié)果表明,在花煙草受到高鹽脅迫后,共有45個ROS清除相關(guān)基因的表達發(fā)生了顯著改變,其中,上調(diào)表達基因28個,下調(diào)表達基因17個。上調(diào)表達的倍數(shù)最小為1.10倍(GST),最高為3.10倍(CAT);下調(diào)表達的倍數(shù)最小為1.14倍(GST),最高為3.32倍(POD43)。上調(diào)表達基因中,數(shù)量最多的為GST(16),其 次 為POD(5)、SOD(4)、CAT(2)和GPX(1)(圖3)。下調(diào)表達基因中,數(shù)量最多的為GST(6),其次為POD(5)、SOD(2)、GPX(2)、APX(1)和GR(Glutathione reductase,2)。綜上所述,花煙草在高鹽脅迫下,其抗氧化的機制主要是上調(diào)抗氧化基因的表達,以啟動相應(yīng)的生理反應(yīng),從而抵御不利的環(huán)境。

    表4 上調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析(分子功能)

    表5 下調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析

    2.6 qRT-PCR驗證

    為了驗證RNA測序結(jié)果的可靠性,隨機選取了POD42、GST1、CAT1、CIPK11、ERF4、GPX4、MYB5和CIPK6等8個基因進行qPCR擴增,并與其測序結(jié)果進行對比(圖4)。從圖4可以看出,2種方法中,所選擇的8個基因的表達趨勢一致,從而說明本研究RNA測序結(jié)果較為可靠,同時也表明,對RNA測序結(jié)果所做的相關(guān)分析較為客觀。

    3 討論

    鹽漬化是植物在生長過程中所遭受到的主要的環(huán)境脅迫之一。在高鹽脅迫下,植物細胞會對自己的生理活動進行調(diào)節(jié),以抵御其對植物生長的影響。其中,活性氧清除系統(tǒng)對鹽脅迫所誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的清除,是主要的生理響應(yīng)過程[4]。高等植物的酶促活性氧清除系統(tǒng)主要包括SOD、POD、CAT、APX、GPX、GST及GR等,其主要的功能,就是將鹽脅迫下在葉綠體、線粒體等細胞器中產(chǎn)生的過量的ROS進行還原,以降低其產(chǎn)生的危害。在本研究中,花煙草在鹽脅迫下,有7類共45個活性氧清除基因的表達發(fā)生了顯著變化(P <0.05),暗示鹽脅迫將導(dǎo)致花煙草眾多的生理進程發(fā)生改變。

    3.1 SOD、POD和CAT

    SOD、POD及CAT是植物最為常見的ROS清除酶類。在逆境脅迫下,植物編碼這3類酶基因表達的提高,酶活性的增強,對ROS的清除能力也大幅度提升,從而提高了植物對不良環(huán)境的抵御能力[4]。研究表明,抗鹽能力較強的基因型,其抗氧化的能力也強,在遭受高鹽脅迫時,其長勢及生物量均較不耐鹽的基因型有較大的優(yōu)勢[1]。同時,當SOD、POD和CAT在植物中過表達時,轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力均顯著增強[8-13]。在本研究中,當花煙草面臨高鹽脅迫時,編碼SOD、POD及CAT 3個酶類的11個基因的發(fā)生了顯著的上調(diào)表達變化。其中,上調(diào)表達最高為3.1倍(CAT)。揭示花煙草響應(yīng)鹽脅迫過程中,SOD、POD和CAT發(fā)揮著十分重要的作用,其中,CAT的作用值得關(guān)注。

    然而,在本研究中,也有5個編碼POD的基因及2個編碼SOD的基因發(fā)生了下調(diào)表達。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的意義需要進一步的研究,同時,此結(jié)果也說明,花煙草對鹽脅迫的響應(yīng),可能存在正向與負向兩種調(diào)控方式,其中,正向調(diào)節(jié)作用可能占主導(dǎo)地位。

    3.2 APX與GPX

    圖2 差異表達基因的KEGG分析

    抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)是2個構(gòu)成植物抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類。APX是一類在高等植物中廣泛存在的亞鐵血紅素蛋白,包括了4個不同的亞型,即葉綠體APX(sAPX)、類囊體APX(tAPX)、微體APX(mbAPX)和胞質(zhì)APX(cAPX)[22]。APX的表達受生物及非生物脅迫因子的廣泛誘導(dǎo)。研究表明,在鹽脅迫下,堿蓬的SsAPX[23]及白樺的APX[24]的表達均顯著升高;擬南芥APX[25]及棗樹ZjAPX[26]的過表達,則顯著增強了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力。

    圖3 花煙草響應(yīng)高鹽脅迫的抗氧化基因

    圖4 RNA測序與qPCR基因表達水平的比較

    GPX也是細胞ROS清除的重要酶類,同樣是由多個同工酶組成的大家族。GPX能夠有效地清除細胞過氧化物,防止ROS對細胞的傷害,并因而在植物生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[27]。例如,衣藻(Chlamydomonas)GPX[28]、小麥GPX[29]的過表達,均增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽、低溫的耐受能力。然而,植物GPX的表達較為復(fù)雜,在大多數(shù)情況下,GPX以上調(diào)表達的方式參與環(huán)境脅迫的響應(yīng)[27],但高粱(Sorghum bicolor)的SbGPX6與SbGPX7[30],在干旱脅迫下卻是下調(diào)表達。

    以上結(jié)果均表明,APX與GPX均參與了植物對鹽脅迫的響應(yīng)。在本研究中,花煙草在鹽脅迫下,有1個GPX上調(diào)表達了1.27倍,另外2個GPX及1個APX均為下調(diào)表達。揭示花煙草APX及GPX參與鹽脅迫響應(yīng)有自己的特點,而且可能主要是負向調(diào)控方式。

    3.3 GST

    谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)也是由多基因編碼的基因家族,其功能較為廣泛,參與了細胞的解毒、抗氧化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程,因而在植物的生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[31]。研究表明,植物的GST參與了高鹽、低溫、干旱、UV及ABA等多種非生物脅迫的響應(yīng)[32]。例如,擬南芥AtGSTU19參與了植物的抗旱與抗鹽脅迫[33];過表達煙草[34]及堿蓬[35]的GST,能夠顯著增強轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力。然而,GST參與植物的逆境脅迫響應(yīng)的方式較為復(fù)雜,如AtGSTU17可能作為負調(diào)節(jié)因子,參與了擬南芥對干旱和鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng),其較低的表達量或基因敲除有助于擬南芥抗性的提高[36]。

    本研究也得出了類似的結(jié)果,在高鹽脅迫下,花煙草22個GST的表達顯著增強,其中,有16個顯著上調(diào)(最高2.81倍),6個則顯著下調(diào)(最高2.22倍)(圖3)。表明在花煙草的高鹽脅迫應(yīng)答中,GST占有舉足輕重的地位,同時,其不同成員間發(fā)揮作用的機制可能并不相同。

    3.4 GR

    谷胱甘肽還原酶(GR)與GST和GPX共同構(gòu)成了谷胱甘肽循環(huán)的重要組件,并且在ROS清除機制中發(fā)揮重要作用[31]。GR的基本功能是催化還原型谷胱甘肽(GSH)的合成,維持細胞內(nèi)的較高水平的還原力;同時,GR還能夠與SOD等酶系統(tǒng)共同作用,清除細胞內(nèi)多余的ROS[37]。所以,GR活性的增強,有利于植物抗氧化能力的提升,并最終提高了植物對生物及非生物逆境脅迫的抵御能力。植物GR在鹽脅迫應(yīng)答中的功能研究報道尚不多見,已有的研究表明,在鹽脅迫誘導(dǎo)下,水稻的GR3[38]、茶樹CsGR1[39]、油菜的GR2[40]、麻風(fēng)樹(Jatropha curcas)JcGR[41]等基因的表達明顯升高;而水稻GR3的敲除,則導(dǎo)致了突變體對鹽脅迫的敏感[42]。但是GR對脅迫的應(yīng)答的方式并不相同,如在鹽脅迫下,茶樹的CsGR2則顯著下降[39]。與此相類似,花煙草在高鹽環(huán)境下只有1個GR發(fā)生了下調(diào)表達(下調(diào)1.33倍)(圖3),說明在花煙草的鹽脅迫響應(yīng)中,GR也可能發(fā)揮著一定的作用,其作用的機制有待于進一步的探索。

    4 結(jié)論

    在鹽脅迫下,花煙草大量的基因發(fā)生了顯著的差異表達。這些差異表達基因的功能,主要集中在生物過程及金屬離子轉(zhuǎn)運等方面。其中,有7大類45個活性氧清除相關(guān)基因的表達模式變化明顯。本研究的結(jié)果說明,花煙草通過改變自身眾多的生理進程,以適應(yīng)外界的鹽脅迫環(huán)境。其中,增強對鹽脅迫所產(chǎn)生的活性氧的清除能力,是花煙草抵御鹽脅迫的主要機制之一。

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