轉(zhuǎn)BpLTP4煙草耐鹽性分析

石晶靜 郭依萍 于穎 周美琪 王超

（東北林業(yè)大學(xué) 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

植物生長(zhǎng)過(guò)程中可能會(huì)受到多種不良環(huán)境的影響，比如高鹽、高溫、干旱、低溫等。高鹽土壤會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)代謝紊亂，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。白樺（B. platyphyllaSuks.）是一個(gè)北溫帶的廣布種，生長(zhǎng)迅速，基本密度、木材硬度、白度、纖維形態(tài)、化學(xué)組分及打漿性能均符合造紙用材的要求，是優(yōu)良的短周期闊葉紙漿用材樹(shù)種，具有全球范圍內(nèi)的廣闊的發(fā)展前景。鑒定白樺耐鹽相關(guān)基因，研究其耐鹽機(jī)制，利用分子育種手段培育耐鹽白樺新品種，對(duì)于困難立地條件下白樺用材林和紙漿材林建設(shè)具有重要意義。

高鹽土壤會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)特異蛋白過(guò)量表達(dá)，有研究顯示脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Lipid transfer proteins，LTP）作為植物體內(nèi)的防御性蛋白在抵抗非生物脅迫中有重要的作用［1］。Kader［2］在研究脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞膜上有蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂并且與脂肪酸物質(zhì)特異性結(jié)合。因此，將這一蛋白命名為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。LTP是一種小分子堿性可溶蛋白，在可溶性蛋白中占4%［3］。LTP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由H1、H2和H3和H4四個(gè)a-螺旋構(gòu)成，并形成一個(gè)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)［4］。LTP蛋白的三維結(jié)構(gòu)含有一個(gè)內(nèi)嵌的疏水腔，推測(cè)疏水腔與磷脂等疏水分子形成復(fù)合體從而實(shí)現(xiàn)磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)。鹽害不僅會(huì)影響植物體內(nèi)特定酶活性還會(huì)影響植物的代謝途徑。有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可以直接影響植物細(xì)胞的膜脂和膜蛋白，加劇膜脂的氧化程度，增大脂膜的透性，破壞植物細(xì)胞膜的完整性，直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)和小分子的有機(jī)物滲透，破壞物質(zhì)交換的平衡［5］。植物會(huì)通過(guò)改變自身的生理和新陳代謝的途徑來(lái)抵抗鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜造成的損傷。因此，研究重點(diǎn)開(kāi)始集中于膜透性的變化［6］。LTP可以在生物膜之間轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)，因此推測(cè)其在植物抗逆過(guò)程中起重要的作用［7］。Torres-Schumann等［8］在鹽脅迫處理番茄后發(fā)現(xiàn)，脅迫6 h后LTP開(kāi)始實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)，脅迫12 h后LTP表達(dá)量達(dá)到最大值。Rabbani等［9］研究發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫水稻后可以誘導(dǎo)LTP表達(dá)。Jang等［10］研究小麥TaLTP1啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下LTP顯著上調(diào)表達(dá)。李誠(chéng)斌等［11］將巴西旱稻中的OsLTP1通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻日本晴中并進(jìn)行耐鹽分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物在1.5%的NaCl培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力明顯高于對(duì)照株系，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻較對(duì)照株系更具有耐鹽性。劉關(guān)君等［12］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能夠誘導(dǎo)西伯利亞寥nsLTP在不同組織中表達(dá)。擬南芥中存在耐鹽LTP［13］，LTP在植物抗鹽的過(guò)程中扮演著重要的角色［14］。但目前對(duì)于LTP響應(yīng)鹽脅迫的分子基礎(chǔ)尚不清楚。

本研究利用擬南芥LTP序列與白樺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選并克隆白樺LTP，研究其序列特征及鹽脅迫響應(yīng)，并將其轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)其耐鹽性進(jìn)行分析，旨為研究LTP的耐鹽分子調(diào)控機(jī)制及分子遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

提取RNA的材料為野生型白樺組培苗，培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)室，溫度為25℃，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度400 μmol/m2s。將東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的SR-1煙草（Nicotiana tabacumL.cv.Petit Havana SR-1）種子用1 mL 20%的NaClO清洗；之后用無(wú)菌水清洗，將清洗后的種子平鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基上，置于組培室中培養(yǎng)2周，將小苗移出到生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)20 d用于侵染。大腸桿菌（Escherichia coli）Top10、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株、植物表達(dá)載體pROKⅡ?yàn)闁|北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。DAB顯色試劑盒（Solarbio，北京）；配制NBT染液時(shí)需要用pH7.8的1mol/L磷酸緩沖液溶解NBT粉末；Evans Blue染液配制用雙蒸水將Evans Blue的粉末溶解后備用。所有染液每100 mL均需中加入10 μL TritonX-100。

1.2 方法

1.2.1BpLTP4的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 利用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）查找耐鹽LTP基因AT5G59310.1，采用同源序列比對(duì)的方法，在白樺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//birch.genomics.cn/）進(jìn)行比對(duì)分析。將獲得的序列利用NCBI blastX程序?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步功能注釋。

根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)克隆引物，引物為L(zhǎng)TPpROKⅡ-F：5'-CTCTAGAGGATCCCATGGCAAGGTTC GCAGCTTT-3'；LTP-pROKⅡ-R：5'-TCGAGCTCGGT ACCCTTACATCATCATCATCATCATCTTGGAACAAT CGGTAG-3'（金唯智，江蘇）。

以白樺組培苗為材料，液氮充分研磨后，用植物總RNA提取試劑盒（Bioteke Corporation）提取白樺的總RNA；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。經(jīng)1%瓊脂糖/EB凝膠電泳檢測(cè)后利用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收（OMEGA）。利用In-Fusion高效連接酶（In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit）將BpLTP4片段與pROKⅡ線性載體50℃連接。將重組載體轉(zhuǎn)入Top10大腸桿菌感受態(tài)中，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR檢驗(yàn)，將陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證（擎科，廣州），測(cè)序序列經(jīng)比對(duì)正確后為pROKⅡ-LTP重組載體。

1.2.2BpLTP4的生物信息學(xué)分析 利用ExPASy提供的ProtScale對(duì)LTP4進(jìn)行親水性分析；利用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)LTP4的跨膜區(qū)域；利用在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)LTP4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用BioEdit軟件對(duì)LTP4蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析；利用MEAG軟件采用 Neighbor-Joining法對(duì)LTP4蛋白及查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得的其他物種耐鹽LTP基因進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.3 鹽脅迫下BpLTP4表達(dá)模式分析 利用熒光定量PCR法對(duì)鹽脅迫下LTP4進(jìn)行表達(dá)量分析，以4周齡的東北林業(yè)大學(xué)野生型土培白樺幼苗為試驗(yàn)材料。用200 mmol/L NaCl澆灌處理幼苗（0、6、12、24和48 h），用植物總RNA提取試劑盒（Bioteke Corporation）提取白樺的總RNA；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）合成第一鏈cDNA。根據(jù)BpLTP4序列設(shè)計(jì)定量引物L(fēng)TP4 F：5'-ATGGCAAGGTTCGCAGCTTT-3'，LTP4 R：5'-TATTCGAAGCAGCATCGAGT-3'，選擇beta-tubulin和ubiquitin（GenBank Ac. Num.：HO112154和FG065618）作為內(nèi)參基因［15］。在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成qRT-PCR反應(yīng)。用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析［16］。

1.2.4 植物工程菌制備 將測(cè)序鑒定成功的BpLTP4-pROKⅡ的大腸桿菌用小劑量質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA）提取質(zhì)粒后用液氮法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含有25 mg/L Rif和50 mg/L Kana的固體LB培養(yǎng)基上，倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3 d。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（25 mg/L Rif 和 50 mg/L Kana）培養(yǎng)，并做PCR鑒定。

1.2.5 葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草 吸取800 μL過(guò)夜活化OD600的陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌于100 mL LB液體培養(yǎng)基（50 mg/L Kana，50 mg/L GM，50 mg/L Rif）中，28℃震蕩培養(yǎng)菌液的OD600于0.4-0.6。將組培的煙草葉片無(wú)菌操作切成2-3 cm的小塊平鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基上備用，將菌液4℃離心10 min后用MS液體培養(yǎng)基重懸加入100 μmol/L AS，將切好的葉片置于重懸液中輕搖8 min；取出煙草葉片，濾紙吸去葉片上多余的菌液，置于分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d；將葉片取出換至選擇培養(yǎng)基中16 h光照/8 h暗培至葉片分化出抗性芽后，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基（50 mg/L Kana）中培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽功能分析

1.2.6.1 鹽脅迫下發(fā)芽率測(cè)定 將野生型煙草種子和BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草種子等量（30±3個(gè)）的點(diǎn)在不含NaCl和含有150 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)10-12 d，觀察生長(zhǎng)情況，計(jì)算煙草種子發(fā)芽率。采用SPSS18.0對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.6.2 鹽脅迫下根長(zhǎng)性狀分析 將野生型煙草種子和BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草種子在不含NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后將其分別轉(zhuǎn)移至含有0和150 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)15 d后，將其平鋪在培養(yǎng)基上測(cè)量其根長(zhǎng)并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS18.0對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.6.3 鹽脅迫下組織化學(xué)染色分析 將野生型煙草種子和BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草種子在不含NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后將其轉(zhuǎn)移至土中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，而后分別對(duì)WT和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行150 mmol/L NaCl澆灌脅迫處理與水澆灌對(duì)照處理5 d，分別剪取脅迫處理和對(duì)照處理的煙草葉片進(jìn)行DAB、NBT及Evans blue化學(xué)染色。

1.2.7 鹽脅迫下生理生化指標(biāo)測(cè)定 將WT煙草種子和BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草種子在不含NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)移至土中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，而后分別對(duì)WT和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行150 mmol/L NaCl澆灌脅迫處理與水澆灌對(duì)照處理35 d，取脅迫處理與對(duì)照處理的植株用液氮研磨后測(cè)定其POD、SOD活性（建成生物工程研究所試劑盒，南京）。采用SPSS18.0對(duì)POD、SOD酶活活性進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 BpLTP4的克隆

在白樺基因組中通過(guò)同源序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析篩選LTP。鑒定出一條白樺LTP，該基因CDS全長(zhǎng)357 bp，氨基酸序列全長(zhǎng)118 aa。將其命名為BpLTP4。利用RT-PCR克隆目的基因獲得長(zhǎng)度為357 bp的基因目的片段（圖1）。

2.2 BpLTP4的生物信息學(xué)分析

BpLTP4的氨基酸親水性預(yù)測(cè)值在0.5-2.5之間，為疏水性蛋白。BpLTP4蛋白的潛在跨膜區(qū)包含1-30位氨基酸，其中1-6位的氨基酸在膜內(nèi)，7-29位的氨基酸是跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，第30位后的氨基酸在細(xì)胞膜外發(fā)揮功能，因此推測(cè)BpLTP4存在一個(gè)潛在的跨膜區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，BpLTP4蛋白主要由α螺旋及不規(guī)則卷曲構(gòu)成，并含有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白由α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲相互盤(pán)繞、折疊三維構(gòu)象（圖2）。多序列比對(duì)結(jié)果顯示BpLTP4蛋白在保守位置帶有8個(gè)Cys殘基，是LTP家族基因重要結(jié)構(gòu)［17］（圖3）。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示BpLTP4蛋白與耐鹽蛋白ThLTP（ACM78614.1）［18］、TaLTP（EF342573.1）［19］、AtLTP3（AT5G59320.1）和AtLTP4（AT5G59310.1）［13］同源性高，因此，推測(cè)BpLTP4具有耐鹽功能（圖4）。

圖1 BpLTP4的PCR擴(kuò)增

圖2 BpLTP4的生物信息學(xué)分析

2.3 鹽脅迫下BpLTP4表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR定量分析結(jié)果（圖5）顯示BpLTP4在脅迫處理6 h，表現(xiàn)出一個(gè)低度的下調(diào)表達(dá)，在12和24 h時(shí)隨著脅迫時(shí)間變長(zhǎng)BpLTP4的表達(dá)量開(kāi)始逐步上升，在脅迫處理48 h時(shí)高度誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明BpLTP4參與鹽脅迫應(yīng)答。

2.4 BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

通過(guò)農(nóng)桿菌階段的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法，獲得CaMV 35S Pronoter驅(qū)動(dòng)BpLTP4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草抗性株系。提取轉(zhuǎn)基因和野生型煙草DNA，用pROKⅡ載體引物對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示BpLTP4成功轉(zhuǎn)入煙草，獲得3個(gè)煙草轉(zhuǎn)基因株系。

2.5 鹽脅迫下發(fā)芽率分析

為分析鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，首先對(duì)其進(jìn)行NaCl處理下的發(fā)芽率分析（圖7），WT和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在不含NaCl的培養(yǎng)基上種子發(fā)芽率為100%，在含有150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，發(fā)芽率均明顯下降，WT的發(fā)芽率僅為11.42%，轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率分別為64.7%、54.54%和51.51%，是WT的5.6倍、4.7倍和4.5倍。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系種子較WT耐鹽性高。

圖3 LTP4蛋白與其他LTP抗性基因蛋白序列比對(duì)分析

圖4 BpLTP4蛋白與LTP其他耐鹽蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 NaCl脅迫處理后白樺BpLTP4表達(dá)量分析

圖6 BpLTP4轉(zhuǎn)基因煙草DNA分子檢測(cè)

圖7 NaCl脅迫處理轉(zhuǎn)BpLTP4煙草種子發(fā)芽情況分析

2.6 鹽脅迫下生長(zhǎng)性狀分析

為進(jìn)一步分析其生長(zhǎng)性狀的差異，將脅迫條件下生長(zhǎng)至15 d的煙草平鋪在培養(yǎng)基上觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，測(cè)量其根長(zhǎng)并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（圖8），在未脅迫處理?xiàng)l件下，對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)及生長(zhǎng)性狀差別不明顯。在150 mmol/L NaCl脅迫條件下，WT葉片出現(xiàn)明顯鹽害性狀，葉片變黃，而轉(zhuǎn)基因株系葉片變色不明顯。轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)是WT的1.099倍、1.233倍和1.242倍。說(shuō)明BpLTP4提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性。

2.7 鹽脅迫下組織化學(xué)染色分析

為進(jìn)一步分析其提高轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性的作用機(jī)制，剪取脅迫處理和未脅迫處理的煙草葉片進(jìn)行組織化學(xué)染色（圖9），未脅迫處理時(shí)的染色情況一致，顏色均淺，脅迫處理后的WT與3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的DAB染色均變深，說(shuō)明脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草的H2O2的積累少于WT。NBT染色情況與DAB染色情況相似，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草清除O2-的能力較野生型煙草強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因株系更耐鹽。在未脅迫處理時(shí)，WT和轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞完整性未受到影響，幾乎不染色。而脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系的染色情況較WT染色淺，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞完整性高于WT。以上結(jié)果說(shuō)明，BpLTP4異源轉(zhuǎn)化煙草通過(guò)清除ROS來(lái)提高煙草的耐鹽性。

圖8 NaCl脅迫處理下轉(zhuǎn)BpLTP4煙草表型分析

圖9 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)BpLTP4煙草組織化學(xué)染色分析

2.8 鹽脅迫下生理生化指標(biāo)測(cè)定

取脅迫處理與未脅迫處理的植株經(jīng)液氮充分研磨后測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性（圖10）。未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與WT的POD、SOD活性差異不明顯，在經(jīng)過(guò)150 mmol/L NaCl脅迫處理后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性分別是WT的1.27倍、1.28倍、1.22倍，SOD活性分別是WT的1.26倍、1.28倍、1.22倍。脅迫處理后WT和轉(zhuǎn)基因株系的POD活性分別是是未脅迫處理的1.18倍、1.38倍、1.33倍、1.39倍。脅迫處理后WT和轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性分別是是未脅迫處理的1.02倍、1.18倍、1.16倍、1.18倍。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草在受到NaCl脅迫處理后通過(guò)提高植物體內(nèi)POD和SOD保護(hù)酶的酶活性來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。

圖10 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)BpLTP4煙草生理指標(biāo)分析

3 討論

高等植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種分子量為3-9 kD的小分子堿性蛋白［15］，占可溶性蛋白的4% 左右。BpLTP4的蛋白分子量為12.31 kD，分子量較棉花［20］、小麥［21］、擬南芥［20］等的LTP家族基因偏大。有研究顯示LTP參與疏水性相互作用，其在細(xì)胞壁擴(kuò)張中起著至關(guān)重要的作用［22］。本研究對(duì)BpLTP4的親水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果也顯示該蛋白為疏水性蛋白。多序列比對(duì)結(jié)果顯示BpLTP4在保守位置帶有8個(gè)Cys殘基是LTP家族基因特有結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對(duì)BpLTP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白由α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲相互盤(pán)繞、折疊三維構(gòu)象，該蛋白具有通過(guò)4對(duì)二硫鍵交聯(lián)的4個(gè)α螺旋構(gòu)成一個(gè)疏水腔結(jié)構(gòu)［23］。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)BpLTP4與其他物種的耐鹽基因具有較高的同源性，因此，推測(cè)BpLTP4也具有耐鹽性。Moraes等［24］用150 mmol/L NaCl脅迫處理水稻后，用qRT-PCR進(jìn)行LTP表達(dá)量測(cè)定發(fā)現(xiàn)LTP7和LTP10參與鹽脅迫應(yīng)答。為了分析BpLTP4是否參與鹽脅迫應(yīng)答，本研究利用qRT-PCR分析BpLTP4在鹽脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)BpLTP4的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，進(jìn)一步說(shuō)明其可能參與植物的耐鹽調(diào)控。

將基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化至模式植物中是研究該基因功能最直接有效的方法，通過(guò)研究轉(zhuǎn)基因植物的性狀或功能的變化來(lái)研究該基因的功能［25］。李?。?8］將ThLTP轉(zhuǎn)入山新楊中，用不同濃度NaCI脅迫處理組培苗，統(tǒng)計(jì)度量分化率、生長(zhǎng)量、生根率、鹽害指數(shù)等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ThLTP山新楊株系提高了植株的耐鹽能力。Xu等［26］用高鹽脅迫處理轉(zhuǎn)NtLTP4煙草進(jìn)行耐鹽功能分析，通過(guò)組織化學(xué)染色及生理生化指標(biāo)測(cè)定發(fā)現(xiàn)NtLTP4在高鹽條件下不僅抑制了植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，而且參與了ROS的清除過(guò)程，因此提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力。為分析BpLTP4是否能夠提高植物耐鹽性，具有耐鹽功能，本研究將BpLTP4利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草，以發(fā)芽率、根長(zhǎng)、及生理生化指標(biāo)測(cè)定作為耐鹽性的度量指標(biāo)，對(duì)BpLTP4煙草轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性進(jìn)行初步分析。發(fā)芽率和根長(zhǎng)指標(biāo)均說(shuō)明BpLTP4能夠提高煙草的耐鹽性。進(jìn)一步利用DAB、NBT和Evans blue染色來(lái)判斷轉(zhuǎn)BpLTP4基因煙草株系與野生型株系在NaCl脅迫處理后細(xì)胞內(nèi)的H2O2、O2-的積累量和細(xì)胞完整性。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系染色情況較WT染色淺，說(shuō)明在NaCl脅迫處理后轉(zhuǎn)基因株系H2O2、O2-的積累量較野生型少，NaCl脅迫處理后轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞完整性更好。本研究進(jìn)而測(cè)定了NaCl脅迫處理后的轉(zhuǎn)BpLTP4煙草株系與野生型株系的POD、SOD酶活活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BpLTP4在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠通過(guò)提高保護(hù)酶活性來(lái)清除ROS，從而提高轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性。

4 結(jié)論

克隆獲得BpLTP4，其CDS全長(zhǎng)為357 bp。BpLTP4為疏水性蛋白，且存在一個(gè)潛在的跨膜區(qū)。該蛋白是有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲相互盤(pán)繞、折疊成三維構(gòu)象。具有LTP家族特有的8個(gè)Cys殘基結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，且與耐鹽基因同源性高。獲得3個(gè)BpLTP4過(guò)表達(dá)煙草轉(zhuǎn)基因株系。BpLTP4轉(zhuǎn)基因株系在150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中發(fā)芽率較野生型高；轉(zhuǎn)基因株系幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)較野生型健康，且根長(zhǎng)較野生型長(zhǎng)；脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因株系的組織化學(xué)染色較野生型淺，POD、SOD活性明顯增高。因此BpLTP4通過(guò)提高保護(hù)酶活性清除ROS來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，具有一定的耐鹽性。