Hp感染根除治療前后慢性胃炎胃黏膜組織中miR-22和NLRP3炎癥小體表達(dá)水平變化分析

陳夢娜 李善高*

幽門螺桿菌（Hp）是一種革蘭陰性微需氧致病菌，可引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤等疾?。?］。1994年，世界衛(wèi)生組織（WHO）下的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將Hp定義為胃癌I類致病物［2］。我國目前Hp感染率高達(dá)50%，含鉍劑四聯(lián)已作為主要的經(jīng)驗(yàn)性根除Hp方案，隨著多種抗生素的高耐藥率，Hp根除已成為臨床中的巨大挑戰(zhàn)，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步證實(shí)。作者通過測定不同Hp感染程度的慢性胃炎患者殺菌前后的胃黏膜組織中miR-22和NLRP3炎癥小體表達(dá)水平變化，初步探討miR-22及NLRP3炎癥小體在Hp感染致病中的作用，為Hp相關(guān)性疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年3月浙江省中醫(yī)院內(nèi)鏡中心慢性胃炎患者105例，其中Hp感染陽性組患者85例，男49例，女36例，年齡20～60歲。根據(jù)感染程度分為輕度（+）18例、中度（++）22例、重度（+++）45例；陰性組20例作為對照組，男11例，女9例；年齡20～60歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①Hp感染患者14C-尿素呼氣試驗(yàn)及病理組織HE染色結(jié)果均陽性；②近期血液有關(guān)指標(biāo)如血常規(guī)、肝腎功能及凝血類等均無明顯異常；③無Hp根除治療經(jīng)歷；④意識清楚，無認(rèn)知障礙等；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月內(nèi)未曾使用抗生素、PPI、非甾體類藥物、大劑量激素、免疫抑制劑等；②嚴(yán)重藥物過敏史、孕婦、哺乳期婦女、藥癮者、酗酒者等；③活動(dòng)性潰瘍、胃大部切除史、胃腸道惡性腫瘤等患者，嚴(yán)重心、腦、肝、腎功能不全，風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，血液系統(tǒng)疾病，神經(jīng)精神性疾病等。本項(xiàng)目經(jīng)浙江省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）14C-尿素呼氣試驗(yàn)：患者保持清晨空腹，檢測前漱口，通過溫涼飲用水（20ml）服用1粒尿素14C膠囊，靜坐15～20min左右，取出呼氣卡，沿呼氣口向卡內(nèi)呼氣1～3min，期間允許換氣，忌吸氣，直至卡上指示窗顏色由橙紅色變成黃色為止。將呼氣卡檢測窗口上的封簽揭去，插入HUBT-20型幽門螺桿菌測試儀，待儀器自動(dòng)對標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果以每分鐘衰變數(shù)（DPM/mmol）表示。評判標(biāo)準(zhǔn)：陰性：DPM＜100；陽性：DPM≥100。（2）胃黏膜組織標(biāo)本采集：所有研究對象均行胃鏡檢查，臨床醫(yī)師在胃鏡下使用活檢鉗鉗取胃竇部位的胃黏膜組織至少2塊，每塊組織大小約0.2cm×0.2cm，其中1塊胃黏膜組織標(biāo)本固定于10%福爾馬林中，另1塊立即于-80℃冰箱內(nèi)冷藏備用。（3）HE染色：取出在10%福爾馬林中固定的胃黏膜組織，沖洗干凈后依次放入低濃度和高濃度的乙醇中脫水處理，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，充分替換出殘留在其中的乙醇。后將標(biāo)本放入石蠟塊中包埋，用切片機(jī)小心切成每片厚度約為4μm的薄片，再次加入二甲苯脫蠟處理，經(jīng)高濃度和低濃度的乙醇及蒸餾水處理好的切片中加入蘇木精染色溶液染色15min，在鹽酸和氨水中各分色幾秒鐘，用蒸餾水沖洗干凈后加入伊紅酒精染色3min，分別使用100%乙醇和二甲苯進(jìn)行脫水透明，并加入中性樹膠，放上蓋玻片封固，放置于烤箱內(nèi)將其烘干，使用電子顯微鏡觀察胃黏膜組織病理形態(tài)改變，并拍照保存。通過在高倍顯微鏡下對胃黏膜組織進(jìn)行觀察，對Hp感染程度進(jìn)行分組，評判標(biāo)準(zhǔn)［3］：切片上未見Hp菌體表示無Hp感染；見菌株分布小于標(biāo)本全長的1/3區(qū)域表示輕度Hp感染（+）；＞1/3標(biāo)本全長，＜2/3區(qū)域表示中度Hp感染（++）；Hp菌株成堆存在，基本分布于標(biāo)本全長表示重度Hp感染（+++）。（4）RT-PCR測定 miR-22，NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表 達(dá) 水平：將置于-80℃冰箱中的胃黏膜組織取出，Trizol法提取總RNA，取總RNA 1μg，以細(xì)胞總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，制成20μl逆轉(zhuǎn)錄體系；以1.0μl DNA作為底物進(jìn)行Real-time PCR：在96X PCR板各空中加入1.0μl cDNA、5xSYBR mix以及目的條帶引物，總反應(yīng)體系為20μl，置于熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃ 15s→63℃ 25s（收集熒光），40cycles，之后進(jìn)行溶解曲線實(shí)驗(yàn)，檢測是否含有非特異性條帶擴(kuò)增。各個(gè)基因的相對表達(dá)水平以2（Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。（5）Western blot測定胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平：將胃黏膜組織置于1～2ml勻漿器中，經(jīng)PBS洗滌后，用剪刀將其剪碎，向其中添加總蛋白提取試劑靜置裂解30min后，將裂解液移至1.5ml EP管中，然后在4℃，12000rpm離心15min，取上清液分裝于1.5ml EP管中并置于-20℃保存。后經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、去離子水震蕩去除浮色，放入含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度，在4℃下孵育過夜，同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與PVDF膜接觸，室溫下孵育1h，洗滌后加入底物孵育，取出硝酸纖維素膜，蒸餾水漂洗后晾干，通過在暗盒中進(jìn)行約10min的曝光來完成顯影和定影。使用Image J軟件分析每個(gè)條帶的光密度，并重復(fù)進(jìn)行3次，靶蛋白的相對表達(dá)＝［靶蛋白（光密度值）/內(nèi)部參數(shù)（光密度值）］×10n。陽性組患者具體服藥方案：泮托拉唑40mg+果膠鉍100mg，2次/d，餐前30min口服；阿莫西林1000mg+克拉霉素500mg，2次/d，餐后口服。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，各組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 所有陽性組患者均嚴(yán)格服用四聯(lián)殺菌藥物14d，療程結(jié)束1個(gè)月后再次接受14C-尿素呼氣試驗(yàn)及胃鏡檢查，服藥期間無明顯身體不適，飲食生活規(guī)律（最后因各種原因失訪10例）?；颊逪p根除率為90.67%，與國內(nèi)相關(guān)指南及共識提出的根除率＞90% 一致［8］。

2.2 RT-PCR測 定 胃 黏 膜 組 織 miR-22、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平 根除治療前，Hp感染陰性組、輕度感染治療組、中度感染治療組及重度感染治療組的miR-22表達(dá)水平分別為（8.46±0.09）、（5.16±0.11）、（4.35±0.06）、（3.27±0.03）；NLRP3 mRNA表達(dá)水平分別為（5.26±0.07）、（9.87±0.03）、（10.66±0.09）、（12.02±0.06）；ASC mRNA 表達(dá)水平分 別 為（6.46±0.7）、（8.97±0.05）、（9.96±0.07）、（11.09±0.10）；Caspase-1 mRNA 表 達(dá) 水 平 分 別為（4.68±0.12）、（6.15±0.06）、（6.83±0.06）、（7.89±0.03），組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hp感染程度越高，miR-22表達(dá)水平越低，NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)水平越高（P＜0.05）。在根除治療成功組中，輕度治療組、中度治療組及重度治療組的miR-22表達(dá)水平分別為（5.93±0.04）、（5.1±0.05）、（4.44±0.06）；NLRP3 mRNA 表達(dá)水平分別為（8.76±0.12）、（9.22±0.04）、（0.96±0.09）1；ASC mRNA 表達(dá)水平分別為（7.65±0.05）、（8.7±0.08）、（10.01±0.10）；Caspase-1 mRNA表 達(dá) 水 平 分 別 為（5.52±0.07）、（6.01±0.11）、（6.88±0.14）， 較 各 組殺菌前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在根除治療失敗組，胃黏膜組織中miR-22及NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)水平在根除治療前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Western blot測定胃黏膜組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平 根除治療前，Hp感染陰性組、輕度治療組、中度治療組及重度治療組的NLRP3蛋白表達(dá)水平分別為（1.95±0.08）、（6.84±0.09）、（9.84±0.07）、（12.56±0.09）；ASC蛋白表達(dá)水平分別為（2.33±0.11）、（7.81±0.07）、（18.36±0.1）、（23.56±0.1）；Caspase-1蛋白表達(dá)水平分別為（2.94±0.09）、（16.05±0.08）、（20.33±0.09）、（25.52±0.1），組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hp感染程度越高，其表達(dá)水平也越高（P＜0.05）。在根除治療成功組中，輕度治療組、中度治療組及重度治療組的NLRP3蛋白表達(dá)水平分別為（3.75±0.1）、（6.27±0.1）、（8.27±0.08）；ASC蛋白表達(dá)水平分別為（3.64±0.08）、（13.58±0.09）、（16.54±0.08）；Caspase-1蛋 白 表 達(dá) 水 平 分 別 為（7.67±0.11）、（11.84±0.09）、（18.32±0.09），較各組殺菌前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在根除治療失敗組，胃黏膜組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平在根除治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Hp最早于1893年由意大利病理學(xué)家Bizzozero首次在動(dòng)物胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)［4］，作為唯一可存活于胃內(nèi)的細(xì)菌，具有嚴(yán)重的致病性，借助特有的毒力因子，長期定植于宿主體內(nèi)，引起一系列Hp相關(guān)性疾?。?］。有研究表明，Hp感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病原因，并且經(jīng)歷從慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、不典型增生到胃癌的病理演變過程，且在此過程中不同階段Hp陽性率也有所差異［6］。我國Hp感染率約為50%～90%，高于發(fā)達(dá)國家平均水平（50%～70%），且Hp感染率在不同年齡階段、種族、信仰以及受教育程度中存在顯著差異［7］。目前主要推薦含鉍劑四聯(lián)作為主要的根除治療Hp方案［8］。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，我國Hp對較多抗生素產(chǎn)生耐藥，明顯降低根除治療率［9］。因此，迫切需尋求一種高效、且副作用小的根除Hp的藥物。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長18-26個(gè)核苷酸的高度保守的小分子RNA，其幾乎可以完全互補(bǔ)靶mRNA 的 3'UTRs（3'Untranslated regions，3'非 編 碼區(qū)），并在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮降解作用；也可以與之不完全互補(bǔ)，在翻譯水平上抑制蛋白質(zhì)的合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［10］。成熟miRNA通常先通過RNA聚合酶II從相應(yīng)的基因組DNA轉(zhuǎn)錄成初級miRNA，再由核酶進(jìn)一步切割而成［11］。越來越多的研究表明，細(xì)菌和病毒感染均可影響哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中miRNA的表達(dá)過程［12］。NLRP3炎癥小體是目前研究較多的炎癥小體，其受體蛋白是NOD樣受體蛋白3，屬于NLRs家族，NLRs家族由N端的Caspase募集和活化結(jié)構(gòu)域或熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）、C端富含亮氨酸的重復(fù)序列和中間的NACHT結(jié)構(gòu)域（NOD結(jié)構(gòu)域）3部分組成。NLRP3炎癥小體是由NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）所組成蛋白復(fù)合物。其在激活后可通過Caspase-1水解前體IL-1β（pro-IL-1β）、前體IL-18（pro-IL-18）和gasdermin D，使其形成并釋放具有活性的IL-1β、IL-18和gasdermin D的N端片段，被多種病原相關(guān)的分子模式或損傷相關(guān)的分子模式活化，在固有免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［13-15］。有研究以Hp聯(lián)合N-甲基-N-亞硝酸脲（MNU）灌胃小鼠胃癌模型為對象［16］，結(jié)果顯示Hp感染組織中miR-22表達(dá)抑制，而對NLRP3的抑制減弱，誘發(fā)NLRP3炎癥小體聚集及激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β。大量研究也表明，NLRP3是miR-22的直接靶點(diǎn)，NLRP3炎癥小體在Hp感染致炎過程中發(fā)揮重要作用。針對miR-22、NLRP3炎癥小體在人Hp感染致炎過程中所發(fā)生的作用，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本資料結(jié)果顯示，Hp陽性組胃黏膜組織中miR-22表達(dá)水平低于陰性組，而NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于陰性組；在成功根除治療后，miR-22表達(dá)水平較前升高，NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較前降低?；诒敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測NLRP3炎癥小體對胃黏膜具有致炎作用，而miR-22起到抑制炎癥的作用，在Hp感染過程中，可能是通過抑制miR-22的表達(dá)，參與激活NLRP3炎癥小體信號通路，致使大量炎癥因子釋放，從而導(dǎo)致胃黏膜的持續(xù)性病理損傷。但其如何導(dǎo)致胃黏膜炎癥改變的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索，明確此作用的關(guān)系可能為臨床中Hp相關(guān)性疾病的防治過程提供理論基礎(chǔ)。