視網(wǎng)膜光損傷動物模型的研究進展

高園園，黃 潔，俞 洋,2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

視網(wǎng)膜色素上皮在視覺的形成中占有重要地位，而近年來由光損傷給人們帶來的視力困擾日益嚴重，開展視網(wǎng)膜色素上皮光損傷的臨床試驗又頗受限制，因此建立與之適應(yīng)的動物模型進而探討視網(wǎng)膜光損傷的機制具有深遠意義。

1 視網(wǎng)膜光損傷機制與研究進展

隨著科技進步，手機、電腦、及一些新的光儀器設(shè)備(如發(fā)光二極管、LED燈、激光燈等)長時間、高頻率使用及間歇性日光照射所引起的視網(wǎng)膜光損傷也不斷發(fā)生。近年來視網(wǎng)膜光損傷及其藥物防治研究逐漸成為眼科領(lǐng)域一個重要的研究課題。視網(wǎng)膜光損傷主要包括熱損傷、機械性損傷和光化學(xué)損傷(不引起明顯溫度升高的、低能量的、相對較長時間的光照所引起的視網(wǎng)膜組織的病理變化)，研究表明光化學(xué)損傷是最常見的一種損傷形式。楊凱轉(zhuǎn)[1]認為視網(wǎng)膜光損傷主要為視紫紅質(zhì)介導(dǎo)的光化學(xué)損傷，視紫紅質(zhì)易吸收光子，遇光分解造成視網(wǎng)膜光損傷。 另有學(xué)者認為在視網(wǎng)膜光損傷中 ,光感受器細胞主要通過凋亡的方式失活 ,其機制可能在于視紫紅質(zhì)漂白過程中產(chǎn)生全反視黃醛或其代謝產(chǎn)物啟動了凋亡程序[2]。二十世紀80年代由于受科學(xué)技術(shù)限制，在判斷視網(wǎng)膜光損傷的方法上，學(xué)者多采用光鏡、電鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及測量組織厚度，隨著科技進步，判斷視網(wǎng)膜光損傷的方法也日趨豐富，如視網(wǎng)膜電圖(ERG)、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)、熒光素血管造影術(shù)、流式細胞術(shù)、免疫印跡等。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium ,RPE)位于視網(wǎng)膜最外層，它是覆蓋于Bruch膜上的一種排列整齊、形狀規(guī)則的六面柱狀單層色素細胞,RPE含有黑色素和脂褐素，是進入眼底光線吸收的主要部位,RPE為感覺上皮層提供營養(yǎng)、吞噬和維持新陳代謝等重要功能。其功能概括如下：(1)“加工廠”：視色素的再生與合成(允許視色素再進入視覺周期)； 合成視網(wǎng)膜下腔的粘多糖；形成血液—視網(wǎng)膜屏障；參與脈絡(luò)膜新生血管形成；生成細胞增殖因子。(2)“維修工”：修復(fù)光感受器和玻璃膜。(3)“輔助站”：從脈絡(luò)膜血管運輸氧氣、水、離子和營養(yǎng)物質(zhì)到視網(wǎng)膜外層；維持視細胞和脈絡(luò)膜毛細血管板。(4)“回收廠”：吞噬、吸收和降解光感受器、外界膜盤[3]。RPE細胞含有大量的線粒體和不飽和脂肪酸，二者對氧化損傷非常敏感，光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激過程失衡，能誘發(fā)活性氧自由基產(chǎn)生，從而造成RPE細胞的一系列損傷、凋亡、膜溶解。而且這些自由基還可以導(dǎo)致感光細胞外段解體、內(nèi)節(jié)線粒體腫脹變性，呼吸鏈生理功能也隨之降低[4]。同時氧化損傷所產(chǎn)生氧的衍生物與不飽和脂肪酸相互作用從而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中的醛類化合物具有細胞毒性[5]，進一步加重視網(wǎng)膜損傷。視網(wǎng)膜RPE光損傷的病理過程與年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related Macular degeneration,AMD)的病理過程有許多共同之處。因而，視網(wǎng)膜RPE光損傷成為近年來眼科領(lǐng)域的研究熱點。由于開展臨床試驗具有一定的局限性，因此建立與之適應(yīng)的動物模型進而探討視網(wǎng)膜光損傷的機制具有深遠的意義。造成動物視網(wǎng)膜光損傷的發(fā)生與發(fā)展受光照波長、光照能量 、時間和方式等諸多因素影響 ,還與視網(wǎng)膜被照部位 、視網(wǎng)膜暗適應(yīng)狀態(tài) 、動物的種屬等因素有關(guān)。

2 不同波段光與光損傷動物模型

2.1 白色光多數(shù)學(xué)者采用白色LED冷光源[6]來制作光損傷動物模型，部分學(xué)者采用白熾燈[7]作為其光源。選用白色光的目的在于其可反應(yīng)多種混合光的綜合作用，能模擬日光對視網(wǎng)膜損傷，從而構(gòu)建類似于AMD的模型。

2.2 藍色光有一部分學(xué)者采用頻率較高、能量較大的藍光作為光源[8]，部分學(xué)者認為藍光下細胞生長速度較慢，并且藍光可引起RPE形態(tài)改變，還會引起血-視網(wǎng)膜屏障功能失常。

2.3 紫外線少數(shù)學(xué)者采用短波長、能量大的紫外線作為視網(wǎng)膜損傷的光源[9]。有學(xué)者認為紫外線對視網(wǎng)膜的光損傷是長期的、慢性蓄積的過程，紫外線誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及活性氧的產(chǎn)生[10]可導(dǎo)致RPE變性、功能減退、基底膜增生甚至發(fā)生凋亡。

2.4 綠色光尚有學(xué)者使用頻率低、能量小的綠色熒光燈[11]作為視網(wǎng)膜光損傷模型的光源。

3 不同種屬動物與光損傷動物模型

3.1 大鼠晝伏夜動、喜獨居、膽小怕驚、喜啃咬、抗病力強、敏感性強、壽命短。多數(shù)學(xué)者都采用2～3個月SD大鼠。有實驗表明裸鼠的視網(wǎng)膜中央上方最敏感 ,在視乳頭周圍和鋸齒緣上的光感受細胞對光損傷的耐受性最強 ；而大白鼠視網(wǎng)膜顳上區(qū)最為敏感。史勝[6]等人研究表明光對視盤上方2mm處的視細胞損傷最重。光照前大鼠處于暗適應(yīng)狀態(tài)時 ,視網(wǎng)膜光損傷最重,體溫升高時光照造成的視網(wǎng)膜損傷加重。(1)循環(huán)光照及暗適應(yīng)：目前多數(shù)實驗動物,在實驗前接受12h明(20～50 lux)及12h暗循環(huán)光適應(yīng)7d,每次光照后立即送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)[11],可使視桿外節(jié)膜盤儲存更多的視紫質(zhì)，而且暗適應(yīng)可以讓實驗動物瞳孔散大，不僅節(jié)省后期散瞳所需時間而且有利于光損傷的發(fā)生。(2)光照時間及光照強度：由于光源選擇、光線的屈光介質(zhì)傳導(dǎo)、視網(wǎng)膜個體差異和急性、慢性光損傷動物模型的不同，以至于出現(xiàn)在實驗中選擇光照時間及強度差別較大的現(xiàn)象。部分學(xué)者采用自制光損傷箱，850～1500 Lux之間累計光損傷36h[8]，而多數(shù)學(xué)者使用2000～6000 lux[6,11]之間累計光損傷6～36 h，在建立急性光損傷模型上，王蕭[12]采用手術(shù)顯微鏡強光(30000±50)Lux照射SD大鼠眼睛30min。大鼠視網(wǎng)膜光損傷動物模型具有以下優(yōu)點：實驗技術(shù)較成熟；來源廣；大鼠視網(wǎng)膜的背中央?yún)^(qū)域可以被認為是人類視網(wǎng)膜黃斑的一個功能類似物，它是最銳利的視覺區(qū)域，動物視網(wǎng)膜損傷的病因和機制與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病發(fā)展機制有許多共同之處。缺點：實驗安全性較低；成本較高。

3.2 小鼠膽小怕驚、晝伏夜動、喜群居、適應(yīng)性差、壽命短、生長快、繁殖力強，是目前世界上研究最詳盡、應(yīng)用最廣泛的哺乳類實驗動物，多數(shù)學(xué)者使用5～8周齡小鼠，15～23g之間。其光損傷動物模型有BALB/c小鼠、WT小鼠、雜交育種小鼠及使用基因敲除技術(shù)篩選的小鼠，使用基因敲除、基因測序、分型等技術(shù)構(gòu)建的靶向載體動物模型能高度模仿人類的某些病變，例如Maeda A[13]構(gòu)建ABCA4-/-小鼠及Rdh8-/-小鼠模型，揭示了AMD的主要特征，提供了視覺周期異常反應(yīng)可引起類似于AMD漸進變化的基因證據(jù)。但是有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Rdh8-/-Abca4-/-小鼠在干和濕型表型都可以由相同的遺傳缺陷誘導(dǎo)[14]。(1)循環(huán)光照及暗適應(yīng)：由于選用小鼠種類的不同，學(xué)者采用循環(huán)光照強度也不同。部分學(xué)者采用12h明(20～30、30～50)Lux 12h暗的光照強度下飼養(yǎng)動物7d[19]，也有學(xué)者考慮到小鼠較大鼠的適應(yīng)性更差及小鼠的生理特性，所以讓小鼠更長時間適應(yīng)于較低光照強度的循環(huán)光照下，有人采用12h明(5lux)12h暗的循環(huán)光照下適應(yīng)14d，Valérie Fontaine[15]采用12h明(10lux)12h暗的循環(huán)光照下適應(yīng)14d，然后在暗室中適應(yīng)36h之后開始光損傷。(2)光照時間及光照強度:由于光源及動物模型的不同，大多數(shù)學(xué)者采用4000～5000 Lux的光照強度[15]，光照持續(xù)時間也不同，有光照1h建立急性視網(wǎng)膜光損傷模型[15]，也有持續(xù)光照持續(xù)3～4 h，比較典型的是LiuY[5]采用12000Lux的強光照射不同時間(30min、60min、75min)以建立急性視網(wǎng)膜光損傷模型。小鼠視網(wǎng)膜光損傷動物模型具有以下優(yōu)點：①體型小，節(jié)省藥品；②性情溫馴，容易捕捉；③容易飼養(yǎng)，技術(shù)成熟；④生長快，繁殖力強；⑤小鼠甚至被認為是AMD的動物模型，因為小鼠可以顯示出部分主要的AMD特征。缺點：①壽命短，適應(yīng)性差，環(huán)境要求條件較高；②其視網(wǎng)膜沒有黃斑，故所有實驗結(jié)果為光對整個視網(wǎng)膜的影響，并非黃斑。

3.3 兔哺乳綱、兔形目、兔科，是生物醫(yī)學(xué)實驗中最常用的動物之一。實驗用兔多為日本大耳白兔、新西蘭兔、青紫蘭兔、中國白兔等，多數(shù)學(xué)者多采用月齡適當、健康、清潔、雌雄不限，體重在1.5～2.5 kg的實驗兔，Khramov R N等人[16]采用4～7個月、體重2.0～2.5 kg青紫蘭兔作為實驗動物。(1)光化學(xué)損傷：多數(shù)學(xué)者采用白色熒光燈作為光源照射兔眼睛，由于光照時間及急慢性視網(wǎng)膜損傷模型不同及具體實驗條件的限制，Liu Y[5]等采用(15000±10001) Lux照射兔眼2h來建立急性光損傷動物模型。(2)暗適應(yīng)：實驗前，大多數(shù)動物在12h明(30～50 Lux)及12h暗的循環(huán)光環(huán)境適應(yīng)7d，光損傷前暗適應(yīng)24h。實驗組散瞳至 8mm左右。兔視網(wǎng)膜光損傷模型具有以下優(yōu)點：①抗病力強，適應(yīng)性好，繁殖力強，來源廣；②兔眼較大，便于手術(shù)和觀察；③兔眼與人眼結(jié)構(gòu)具有相似性；④兔兩眼可以做對照實驗；⑤兔與猴的視網(wǎng)膜損傷閾較近、均較高，可能更接近人的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。缺點：兔沒有黃斑。

3.4 鵪鶉體型小、體重輕、活潑愛動、排序性強、行動敏捷，食性廣、喜干燥、惡潮濕，公鵪鶉好斗。P Zak[7]等人使用4～5月齡性成熟雌性日本鵪鶉，使用白熾燈、LED藍光及黃光下飼養(yǎng)鵪鶉。已知RPE細胞捕獲光受體膜的吞噬過程依賴于光，并表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，有學(xué)者認為鵪鶉視網(wǎng)膜光損傷模型是小型家禽研究光損傷動物模型中最成功的模型之一[9]。日本鵪鶉與常規(guī)的實驗動物(嚙齒動物、貓、狗等)相比，具有敏銳的中央視力，被葉黃素、玉米黃質(zhì)、氧類胡蘿卜素保護，藍光照射對其損害較小。鳥類的視網(wǎng)膜視敏度隨著的年齡而明顯下降[17]，9個月大的日本鵪鶉RPE中脂褐素顆粒的濃度與80歲成人RPE水平相似[17]。鵪鶉視網(wǎng)膜光損傷模型具有以下優(yōu)點：鵪鶉除了利用脂褐素作為加速衰老的模型外，還有助于研究褪黑激素調(diào)節(jié)的晝夜節(jié)律，創(chuàng)新性較高，拓展了實驗方法。缺點：保種難，耗資多，脫離生產(chǎn)實際，實驗技術(shù)欠成熟，可重復(fù)性有待考究。

盡管視網(wǎng)膜光損傷帶給人類的困擾很多，但其發(fā)生機制仍無明確的結(jié)論，可能與線粒體損傷、細胞凋亡、自由基和脂質(zhì)過氧化及細胞自噬相關(guān)。目前尚無統(tǒng)一的標準制造出光損傷動物模型，隨著高效化、科學(xué)化、規(guī)范化光損傷動物模型的建立及AMD研究的不斷深入，AMD的誘因和發(fā)病機制也將會逐漸明確。