循環(huán)腫瘤DNA在食管癌患者中的研究進展 *

殷文明，蔣敬庭，吳昌平

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術研究中心，蘇州大學細胞治療研究院，江蘇常州213003)

食管癌患者早期癥狀不明顯，治療預后差，總體5年生存率僅為15%～25%[1]。傳統(tǒng)的影像學技術和腫瘤標志物檢測在食管癌的早期診斷、治療后隨訪及病情評估方面存在諸多局限。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)檢測取材方便，靈敏度高，且能實時檢測腫瘤轉移及評估腫瘤進展，作為一種新型分子標志物近年來越來越受到人們關注[2-4]。研究發(fā)現，在胰腺癌、結直腸癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤中ctDNA檢出率高達75%[5]。本文就ctDNA在食管癌治療領域的最新研究進展進行總結，旨為食管癌的精準診療提供新策略。

1 ctDNA及相關檢測技術

1.1ctDNA 健康人外周血中存在游離DNA片段(cell-freeDNA，cfDNA)，而腫瘤患者體內的cfDNA含量明顯高于健康人群，晚期腫瘤患者體內含量更多。這部分來源于腫瘤的cfDNA即為ctDNA。cfDNA在DNA釋放過程中保留了核染色質的某些特征。腫瘤患者的cfDNA中含有各種與腫瘤基因突變相同的體細胞突變，如致癌基因和抑癌基因的突變、微衛(wèi)星變化、啟動子甲基化和雜合性缺失等。

cfDNA分子大小為500～30 000 bp，而ctDNA片段長度僅為150～200 bp[6]。ctDNA的半衰期在15 min至數小時不等，平均約2 h[7]。ctDNA來源于腫瘤細胞的壞死及凋亡；血液循環(huán)或微轉移灶中腫瘤細胞的溶解釋放；腫瘤細胞主動釋放DNA進入血液循環(huán)；血液中的DNA酶抑制劑抑制血漿DNA降解，使DNA在血液中富集等。多數研究認為，細胞的凋亡、壞死和分泌是ctDNA的主要來源。

1.2ctDNA檢測方法 外周血中ctDNA數量較少，占cfDNA總數的0.01%～1%，需用高特異性、高靈敏性方法進行檢測。主流的檢測方法有數字聚合酶鏈式反應(digital PCR，dPCR)、突變擴增阻滯系統(tǒng)(amplified refractory mutation system，ARMS)、新一代測序法(next-generation sequencing，NGS)等[8]。ARMS和dPCR法檢測靈敏度高，可絕對定量，缺點是僅能檢測已知突變位點和基因重排。NGS法可進行全基因組的單核苷酸變異、拷貝數變異檢測，基因重排和擴增，可檢測未知突變。然而其敏感性和特異性受DNA聚合酶的錯誤率和測序反應的限制，并且檢測耗時長。

ctDNA檢測技術包含定量檢測和定性檢測。有學者研究發(fā)現，ctDNA濃度與患者體內腫瘤負荷大小呈正比，通過定量檢測外周血ctDNA濃度，可根據濃度的高低來推測腫瘤情況。但凝血過程中淋巴細胞破裂釋放DNA可影響循環(huán)DNA檢出水平。定量分析時，血漿相對血清能更準確地反映機體循環(huán)DNA的真實水平，但血液必須在采集后1～4 h內離心分離[9]。

腫瘤的表觀遺傳變異類型包括DNA甲基化、基因拷貝數變化、單堿基突變、基因融合、原癌基因異常表達等[10]。ctDNA的定性分析即是對腫瘤特異性基因突變的檢測。研究表明，在食管癌患者血漿中cfDNA的分布與相應腫瘤組織中檢測到的DNA分布呈高度一致[11]。通過對ctDNA的監(jiān)測能夠檢測到腫瘤患者組織和血漿中存在的特有突變，準確地對腫瘤進行分型，從而指導臨床治療。

2 ctDNA在食管癌患者中的應用

ctDNA的分析應用可貫穿于惡性腫瘤的整個診治過程，如組織病理標本獲取困難的腫瘤患者治療策略的制定，治療過程中監(jiān)測治療反應和識別耐藥性突變的出現等。許多研究已證實，同時檢測的血漿和組織樣本之間關鍵位點的改變，其一致性高達80%～90%[12-14]。另有研究表明，食管癌患者攜帶的腫瘤相關單核苷酸變異、拷貝數改變及結構變異等遺傳學改變，為食管癌的診斷、監(jiān)測腫瘤負荷及治療療效、預測疾病復發(fā)及判斷預后等提供了依據[15]。

2.1ctDNA在食管癌早期診斷中的應用 腫瘤早期發(fā)現是減少腫瘤相關死亡的關鍵環(huán)節(jié)之一。早期食管癌沒有特異性臨床癥狀，確診時多處于中晚期。但ctDNA的異常在腫瘤發(fā)生的早期就可檢測到。食管鱗癌患者血漿ctDNA水平顯著高于健康人群，并且TNM分期為晚期以及發(fā)生淋巴結轉移患者的血漿ctDNA水平顯著高于TNM分期早期和未發(fā)生淋巴結轉移的患者。

DNA甲基化是目前發(fā)現的在食管癌分子診斷中具有廣泛應用前景的一種生物學標志物，并且與常規(guī)腫瘤標志物無相關性。研究表明，循環(huán)DNA中檢測到的CASZ1、CDH13和ING2基因高甲基化可作為食管癌診斷的一種潛在的生物學標志物[11]。Fece等[16]研究了超過9 000個CpG位點的cfDNA甲基化評分后發(fā)現，cfDNA甲基化評分用于預測癌癥類型的準確性可以達76.3%。這提示血漿游離DNA甲基化譜可作為潛在的生物學標志物應用于食管癌的診斷。

此外，微衛(wèi)星改變也可以從食管鱗癌患者的血清標本中發(fā)現。例如Eisenberger等[17]檢測了食管癌患者的腫瘤及血清中微衛(wèi)星情況，并以健康個體作為對照，結果發(fā)現92.9%的食管鱗癌患者原發(fā)腫瘤中有1個或多個微衛(wèi)星DNA改變，96.4%的患者血清中至少有1個微衛(wèi)星DNA變化，而健康人對照者血清DNA中均未發(fā)現微衛(wèi)星改變，提示血清微衛(wèi)星DNA分析也是檢測食管鱗癌的1個具有潛在臨床應用價值的指標。

2.2ctDNA在食管癌治療中的應用 早期食管癌僅需接受單純的手術或放療，而中晚期食管癌的標準治療方案為同步放、化療。最近一項研究表明，食管腺癌患者ctDNA數量和突變頻率均隨腫瘤分期增加而增加，并可在臨床或影像學發(fā)現腫瘤進展前檢測到ctDNA水平變化[18]。因此，對于臨床分期為早期但伴有ctDNA數量或頻率增加的患者給予更積極的治療或可改善這部分患者的預后。

晚期轉移性食管癌通常接受全身藥物治療。研究顯示，上消化道腫瘤患者的不同轉移病灶和原發(fā)腫瘤間的MET基因擴增具有顯著的異質性[19]。單病灶活檢的分子譜不足以指導靶向治療藥物的選擇。ctDNA來源于全身腫瘤，能克服腫瘤區(qū)域異質性問題，較全面地反映腫瘤基因全貌。

Petty等[20]設計了一項多中心前瞻性雙盲實驗，發(fā)現吉非替尼治療的EGFR擴增食管癌患者與安慰劑組相比其總體生存率顯著提高，但在EGFR陰性食管癌患者中，吉非替尼組與安慰劑組相比總體生存率沒有顯著差異。相關研究證實，血漿ctDNA中EGFR的突變狀態(tài)與相應的腫瘤組織相一致，提示可以使用血漿ctDNA替代組織來評估EGFR突變狀態(tài)，篩選出適合接受吉非替尼治療的患者[21]。

值得關注的是，食管鱗癌和食管腺癌在發(fā)病機制上顯著不同，也具有明顯不同的分子特征。食管鱗癌表現出頻繁的CCND1、NOTCH1、SOX2和/或TP63的基因組擴增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4和GATA6基因改變則在食管腺癌中更為常見[22-23]。應慎重對待文獻中關于食管癌藥物治療的相關結論。

2.3ctDNA在評估食管癌患者預后及轉移復發(fā)中的應用 早期發(fā)現對于復發(fā)后早期干預和延長患者生存非常重要。目前臨床上采用的血液腫瘤標志物的陽性率低，難以及時發(fā)現腫瘤進展，而ctDNA可以作為腫瘤微小殘留的潛在生物學標志物預測腫瘤患者預后。ctDNA異常升高意味著患者具有更高的復發(fā)風險。研究表明，晚期實體腫瘤患者血漿循環(huán)DNA的中位濃度可達健康志愿者的3倍以上，且濃度越高，總體存活率越低[24]。通過動態(tài)監(jiān)測ctDNA可以先于影像學檢查數周至數月發(fā)現腫瘤進展[25-26]。

通過檢測ctDNA的腫瘤相關突變及甲基化也可以預判食管癌患者的預后。Ling等[27]采用實時甲基化特異性PCR(real-time MSP)對209例食管鱗癌患者的腫瘤組織樣本和血漿樣本MSH2基因啟動子高甲基化進行分析，結果顯示209例食管鱗癌患者中有101例組織樣本發(fā)現異常MSH2甲基化，而其中77例的血漿DNA樣本發(fā)生了相同的變化。隨訪數據顯示，血漿DNA中MSH2高甲基化的食管鱗癌患者術后無病生存期(disease-free survival,DFS)明顯低于MSH2非甲基化患者(RR=21.357,95%CI:8.448～55.279,P=0.000)。Pennathur等[28]通過回顧癌癥基因組圖譜項目數據以及食管癌分子分層和分類的進展，發(fā)現食管腺癌中的基因表達譜也與患者預后顯著相關。以上研究提示，ctDNA甲基化狀態(tài)無論對食管鱗癌還是食管腺癌都是具有臨床應用價值的預測因子。

此外，血漿DNA中CCND1基因擴增的食管鱗癌患者復發(fā)頻率明顯升高，無復發(fā)生存時間較短，是判斷復發(fā)的獨立危險因素[29]。食管癌患者ERBB2基因擴增與患者存活率之間也存在顯著關聯，但僅有約7%的患者可以檢測到ERBB2擴增[30]。聯合檢測多個基因組異?；蚩商岣哐獫{DNA預測食管癌復發(fā)的效率。

3 小結及展望

液體活檢成為近年來的研究熱點。雖然循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)也可動態(tài)監(jiān)測腫瘤狀態(tài)，但CTCs有著極高的異質性并存在上皮-間質轉化(EMT)等缺陷，尚未能在臨床上廣泛使用。ctDNA可先于影像學檢查診斷早期腫瘤，并可在疾病過程中動態(tài)監(jiān)測，且克服了腫瘤內異質性，提供更完整的信息。但ctDNA在食管癌的臨床應用仍存在諸多挑戰(zhàn)，如ctDNA檢測的標準化、敏感性仍有欠缺，尤其對ctDNA水平較低者，同一血液樣本采用不同測序方法的檢測結果也存在差異。綜上所述，作為非侵襲性診斷標志物，ctDNA在食管癌的早期診斷、治療、預后評估以及個體化治療等方面具有重要作用，隨著分子標記研究的不斷深入，ctDNA將為食管癌的診治及預后改善提供新手段。