基于心肌細(xì)胞能量代謝及鈣穩(wěn)態(tài)探討附子作用機(jī)制

蒲科婷，王志琪，2*，李耀偉，鄧凱文，張序晴，叢夢(mèng)靜，彭 蘭，曾 嶸

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程中心，湖南 長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007）

附子是中醫(yī)臨床中常用的溫陽(yáng)藥物，若辨證得法、使用得當(dāng)則不論對(duì)慢性疾病或是危急重癥均可取得顯著療效，然而在臨床實(shí)踐時(shí)因附子使用不當(dāng)導(dǎo)致中毒甚至死亡的案例亦不在少數(shù)[1]。 漢代名醫(yī)張仲景擅長(zhǎng)使用附子類方劑，將其用于治療各類虛寒疾病，究其本質(zhì)在于附子可通過(guò)不同配伍、用法發(fā)揮程度不同的溫陽(yáng)作用，從而發(fā)揮不同的治療作用[2]。但畏于附子之峻猛毒性，眾多臨床醫(yī)家并不能放膽使用，從而導(dǎo)致其不能充分發(fā)揮療效，故若能闡明附子溫陽(yáng)作用的毒效關(guān)系與機(jī)制，不僅可指導(dǎo)其臨床安全用藥，還可為研究此類毒效并存的藥物提供思路方法[3]。

中醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為人與自然界的生命都是由陰陽(yáng)二氣演化而來(lái)[4]。 中醫(yī)臟腑理論認(rèn)為心屬火，為陽(yáng)中之陽(yáng)，其主一身之血脈的功能有賴于心陽(yáng)的溫煦推動(dòng)作用；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心臟維持正常的搏血功能需要保證其有充足的能量供應(yīng)及有力量有節(jié)律的收縮舒張，這與心陽(yáng)之溫煦推動(dòng)作用相吻合?；诖?，課題組通過(guò)文獻(xiàn)學(xué)習(xí)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)：附子類方劑治療心衰的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated proteinkinase, AMPK）通路改善能量代謝及調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白（calmodulin, CaM）改善鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)，且AMPK 能量代謝通路及CaM 兩者之間存在關(guān)聯(lián)，故以此對(duì)附子溫心陽(yáng)的相關(guān)機(jī)制加以論述。

1 附子溫心陽(yáng)作用與調(diào)節(jié)AMPK 通路的關(guān)系

1.1 心衰心臟的能量代謝

現(xiàn)代研究認(rèn)為陽(yáng)氣的溫煦功能與能量代謝有關(guān)，如陽(yáng)虛體質(zhì)的大學(xué)生能量代謝數(shù)據(jù)，脾陽(yáng)虛大鼠、腎陽(yáng)虛大鼠線粒體功能研究均表明在陽(yáng)虛狀態(tài)下機(jī)體能量代謝水平明顯降低[5-8]。 健康成年人的器官中能量需求最大的是心臟[9]，正常情況下，心肌細(xì)胞所需的約95%的三磷酸腺苷主要由脂肪酸和碳水化合物經(jīng)線粒體分解代謝產(chǎn)生，另有不到5%的三磷酸腺苷來(lái)自糖酵解[10]。在心力衰竭狀態(tài)下，心肌細(xì)胞產(chǎn)生三磷酸腺苷的能力、對(duì)脂肪酸的攝取能力和利用率均明顯下降[11-12]；與此同時(shí)，未被利用的脂肪酸促使線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白合成增多，過(guò)量的解偶聯(lián)蛋白降低了線粒體膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)梯度，阻礙了三磷酸腺苷的生成；此外，解偶聯(lián)蛋白還促進(jìn)了活性氧的產(chǎn)生，而活性氧可進(jìn)一步的引起線粒體受損；如此的惡性循環(huán)致使心肌處于能量嚴(yán)重缺乏狀態(tài)[13]。在代償機(jī)制下，心肌細(xì)胞的糖酵解和磷酸戊糖代謝有所增強(qiáng)，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物乳酸的水平升高[14]，然而乳酸會(huì)損傷心肌細(xì)胞，故心肌細(xì)胞的此種代償不僅未能改善衰竭心臟的能量代謝，反而加重了心肌細(xì)胞損傷。

1.2 AMPK 通路與能量代謝的調(diào)節(jié)

AMPK 是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，由于AMPK對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝情況非常敏感，常將其視為反映機(jī)體能量代謝功能的指標(biāo)[15]，AMPK 通路的激活則是體內(nèi)對(duì)抗并改善能量代謝不足的機(jī)制之一。細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷的濃度、磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）與三磷酸腺苷比值的變化均可影響AMPK 的激活[16]，進(jìn)而使其調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝。

心衰時(shí)，心肌細(xì)胞所產(chǎn)生的三磷酸腺苷不足，AMPK 通路被激活并通過(guò)多種途徑提高了細(xì)胞對(duì)能量代謝底物脂肪酸與葡萄糖的攝取和利用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖原的分解等，從而增加了心肌細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷。活化的AMPK 調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的具體作用環(huán)節(jié)有增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體FAT/CD36 和膜相關(guān)脂肪酸結(jié)合蛋白FABPpm 的蛋白表達(dá)和質(zhì)膜含量[17]，升高細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4 的水平并促進(jìn)其向心肌細(xì)胞膜移位[18]；抑制糖原合成酶活性并增強(qiáng)糖原磷酸化酶活性，以此調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的糖原合成改善糖代謝[19]；增加磷酸果糖激酶的表達(dá)[20]。

除了對(duì)細(xì)胞能量代謝底物進(jìn)行調(diào)節(jié)，AMPK 還可減少活性氧的產(chǎn)生從而緩解其對(duì)線粒體的損傷[21]，提高細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量、促進(jìn)線粒體DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等以改善心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝。其中后者的機(jī)制比較復(fù)雜，主要涉及過(guò)氧化物酶體增殖物受體共激活因子1α（peroxisome proliferators-ctivatedrecep tors co-activator, PGC-1α） 和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mito chondrial transcription factor A, mtTFA）。 其 中，PGC-1α 既可調(diào)節(jié)線粒體的氧化代謝，亦可調(diào)控線粒體的基因表達(dá)，而mtTFA 的主要功能為調(diào)控線粒體的合成。心肌細(xì)胞內(nèi)活化的AMPK，以磷酸化的方式激活PGC-1α，激活的PGC-1α 與細(xì)胞核呼吸因子1（nucleus respiratory factor 1, NRF1）、細(xì)胞核呼吸因子2（NRF2）及ERRA 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，從而激活mtTFA，最終增加線粒體的轉(zhuǎn)錄與合成[22]；心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增大也可激活A(yù)MPK，被活化的AMPK 促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase, Nampt）的表達(dá)，進(jìn)而提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平，使得沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1, SIRT1）被激活，活化的SIRT1 以脫乙?；磻?yīng)激活PGC-1α，AMPK 通過(guò)此途徑也可促進(jìn)線粒體的轉(zhuǎn)錄合成[23]。

1.3 附子作用于AMPK 通路以改善心肌能量代謝

近期，有學(xué)者從AMPK 通路研究了附子對(duì)能量代謝影響。其中，LU 等[24]研究表明干姜附子水煎液既可明顯促進(jìn)心衰大鼠心肌細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2 4 種蛋白mRNA 的表達(dá)，還可明顯提高大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2蛋白的含量，因此，干姜附子配伍改善心功能可能是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK 通路改善心肌細(xì)胞中線粒體的功能實(shí)現(xiàn)的。DENG 等[25]的研究認(rèn)為附子中的苯甲酰烏頭堿可能是其調(diào)節(jié)AMPK 通路的主要活性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAC 可增強(qiáng)小鼠耗氧量，促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中線粒體mtDNA 的復(fù)制，增加三磷酸腺苷的生成；苯甲酰烏頭堿還能提高線粒體中AMPKα、PGC-1α、NRF1 等與AMPK 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。 上述研究成果提示，附子溫心陽(yáng)作用與調(diào)節(jié)AMPK 通路改善能量代謝的作用直接相關(guān)，可以此為基礎(chǔ)開(kāi)展更深入的探究。

2 附子溫心陽(yáng)作用與改善鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)系

2.1 心肌的舒縮與鈣穩(wěn)態(tài)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心主一身之血脈，而心臟推動(dòng)全身血液運(yùn)行，有賴于其有力量有節(jié)律的搏動(dòng)；生理學(xué)認(rèn)為心臟能夠正常的舒張收縮的基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞正常的興奮性。 中醫(yī)學(xué)心陽(yáng)虛證一般被認(rèn)為與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的急慢性心力衰竭的主要癥狀比較相似，心衰時(shí)心臟搏血力量不足且往往伴隨心律失常[26]。 而鈣離子對(duì)心肌細(xì)胞興奮性具有重要作用，故心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及其變化與心臟之推動(dòng)功能可能密切相關(guān)，如若心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，心臟功能也將受到影響。

在多種門控蛋白的配合下，心肌細(xì)胞中的鈣離子濃度能夠維持正常的動(dòng)態(tài)變化，以完成心肌正常的收縮-舒張。肌漿網(wǎng)是存儲(chǔ)Ca2+的主要細(xì)胞器，心臟收縮初期所需92%的鈣離子由其提供[27]。其調(diào)節(jié)鈣離子濃度的具體途徑為：當(dāng)心肌細(xì)胞興奮時(shí)，心肌細(xì)胞膜上的L 型Ca2+通道（LTCC）開(kāi)放，細(xì)胞外少量Ca2+經(jīng)LTCC 進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而激活肌漿網(wǎng)的蘭尼堿受體鈣釋放通道（ryandine receptor calcium release channel, RyRs），引起其發(fā)生“鈣致鈣”釋放；釋放進(jìn)入胞質(zhì)的Ca2+與肌鈣蛋白結(jié)合，伴隨消耗一定量的三磷酸腺苷，引起心肌收縮[28]；在心肌興奮-收縮完成后，心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+主要由肌漿網(wǎng)鈣泵及Ca2+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶將其從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)入至肌漿網(wǎng)再次儲(chǔ)存；細(xì)胞內(nèi)的Ca2+還可在鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger, NCX）和Na+-K+-ATP 酶的配合下以“一鈣出，三鈉進(jìn)”的方式轉(zhuǎn)出[29]，當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度降至7～10 mol/L 時(shí)，心肌細(xì)胞舒張，但是無(wú)論心肌收縮或舒張均需消耗三磷酸腺苷。

2.2 鈣調(diào)磷酸酶與鈣穩(wěn)態(tài)

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/camodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ）是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是CaM家族中重要的一員。在正常的心肌細(xì)胞中，70%的鈣離子由肌漿網(wǎng)重新攝取，剩余的30%由NCX 轉(zhuǎn)出細(xì)胞外[30]?；罨腃aMKⅡ可直接磷酸化肌漿網(wǎng)鈣泵導(dǎo)致肌漿網(wǎng)回?cái)z鈣離子的能力下降低，還可磷酸化NCX1使其不能將鈣離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞，以致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致心肌收縮舒張的時(shí)間延長(zhǎng)，心肌收縮力不足，最終引發(fā)或加重心衰。

CaMKⅡ的結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)域部分共有4 個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，其中2 個(gè)位點(diǎn)被占據(jù)，只有當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度增高時(shí)，升高的鈣離子方能與其余2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合[31]，繼而激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ可通過(guò)磷酸化多種CaM，包括LTCC、RyRs、NCX 等，影響鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。如激活的CaMKⅡ可再次開(kāi)放LTCC 引發(fā)鈣超載[30]，還可減少RyR2 的關(guān)閉量，使原本儲(chǔ)存于肌漿網(wǎng)的鈣離子大量外流[32]。

2.3 附子對(duì)CaM 的作用

近年來(lái)，關(guān)于附子調(diào)節(jié)CaM 的研究逐漸增加，研究表明附子苷促進(jìn)大鼠心臟中CaM 的作用與藥量呈正相關(guān)[33]；附子可糾正陽(yáng)虛大鼠鈣調(diào)蛋白的表達(dá)，提示附子溫陽(yáng)作用與調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白有關(guān)[34]；而高劑量的附子則可增強(qiáng)其心臟中CaMKⅡ的表達(dá)并加重大鼠心衰[35]。對(duì)附子主要活性成分烏頭堿的深入研究則顯示，烏頭堿可促進(jìn)大鼠心室肌細(xì)胞膜上LTCC開(kāi)放，引起鈣超載，最終導(dǎo)致心律失常[36]；烏頭堿所引發(fā)的鈣瞬變幅度降低而頻率增加效應(yīng)與其劑量呈正相關(guān)，且可通過(guò)下調(diào)肌漿網(wǎng)鈣泵、上調(diào)RyR2 的表達(dá)引起鈣超載[37]；附子中的另一成分次烏頭堿可促進(jìn)心肌細(xì)胞LTCC 和RyR2 mRNA 的表達(dá)，導(dǎo)致鈣超載，繼而誘發(fā)心律失常[38]。

3 附子對(duì)心臟及AMPK、CaM 的作用

以上論述表明，心陽(yáng)之溫煦推動(dòng)作用與心肌細(xì)胞線粒體的能量代謝及鈣穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，而線粒體的功能與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)之間存在著密切聯(lián)系：一方面，維持鈣穩(wěn)態(tài)需要充足的三磷酸腺苷；另一方面，心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)是心肌細(xì)胞線粒體生成三磷酸腺苷的前提，同時(shí)線粒體可吸收胞漿內(nèi)游離的Ca2+以緩沖心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的Ca2+[39]。

胞漿中的Ca2+要進(jìn)入線粒體，必須經(jīng)線粒體上的鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（mitochondrial calciumuniporter，MCU）轉(zhuǎn)運(yùn)，而只有高濃度的Ca2+才能激活該通道。MCU 由必要的線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體調(diào)節(jié)器、線粒體Ca2+攝取器1（mitochondrial calciumuptake one,MICU1）和線粒體Ca2+攝取器2（MICU2）組成[40]。 因此，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加時(shí)，MCU 開(kāi)放增加，促使線粒體吸收游離的Ca2+以調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)；但當(dāng)Ca2+濃度過(guò)高時(shí)，則會(huì)破壞線粒體內(nèi)部的鈣穩(wěn)態(tài)，繼而損傷線粒體的結(jié)構(gòu)及功能[41]。而當(dāng)能量代謝不足時(shí)，線粒體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧又會(huì)直接或間接地促進(jìn)Ca2+內(nèi)流；可見(jiàn)心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)及線粒體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)和線粒體的功能之間存在密切聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿配伍甘草次酸可顯著降低心肌細(xì)胞烏頭堿中毒所致的RyR2 過(guò)表達(dá)， 同時(shí)增加NCX1 的表達(dá)，緩解細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞膜L 型電壓門控鈣通道蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮功能[42]；附子煎液可降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，破壞線粒體功能，并可抑制PGC1-α 的表達(dá)，從而降低線粒體緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用[43]；而干姜附子湯在改善心衰的同時(shí)可上調(diào)MCU、MICU1、MICU2 蛋白的表達(dá)，提示其治療心衰的作用可能與調(diào)控MCU 改善線粒體功能有關(guān)[44]；參附注射液可改善心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)及功能，增加三磷酸腺苷產(chǎn)量，還可增加衰竭心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)鈣儲(chǔ)量、降低胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，間接增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力，促進(jìn)心衰大鼠心功能的恢復(fù)[45]。上述實(shí)驗(yàn)及結(jié)果提示，附子溫心陽(yáng)作用機(jī)制可能與改善線粒體功能及調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)，且兩者之間存在聯(lián)系。

綜上所述，心陽(yáng)之盛衰與心肌細(xì)胞能量代謝及鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)，而線粒體功能是聯(lián)系細(xì)胞能量代謝和鈣穩(wěn)態(tài)的一個(gè)樞紐，因此，可以調(diào)控線粒體與胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度變化的關(guān)鍵通路MCU 為切入點(diǎn)，將AMPK-CaM 通路相結(jié)合探究附子的溫陽(yáng)作用及其毒效關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)MCU、MICU1、MICU2 的表達(dá)并與線粒體及胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度變化相聯(lián)系，有望表征附子溫心陽(yáng)的毒與效。

4 小結(jié)

由于中醫(yī)學(xué)陽(yáng)氣概念是對(duì)人體多種功能宏觀整體的概括，而附子的溫陽(yáng)功效亦是對(duì)多途徑多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)作用的概括，且中藥的藥效是以辨證論治為基礎(chǔ)，故在研究時(shí)應(yīng)以附子及其配伍組合的整體藥效為研究對(duì)象，以多通路多靶點(diǎn)結(jié)合的方式對(duì)其進(jìn)行研究，如此可更加貼合中醫(yī)藥之整體觀念，再以中醫(yī)辨證論治思想為指導(dǎo)，通過(guò)對(duì)比其對(duì)不同證型下心臟或心肌細(xì)胞的作用，可更加全面的說(shuō)明其毒與效，故以AMPK-CaM 通路結(jié)合研究附子溫心陽(yáng)作用機(jī)制并探索其毒效關(guān)系，或可更加接近其作用本質(zhì)。