高效液相-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法分析六神丸在大鼠肝臟中代謝的砷形態(tài)

陳吳越，崔欣語，周昊言，王佳佳，周婧，呂翔，馬宏躍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

六神丸作為常用的中成藥，由雄黃、冰片、麝香、牛黃、蟾酥和珍珠組成，具有清熱解毒、消腫止痛、強(qiáng)心等功效。由于含有雄黃和蟾酥兩種有毒中藥，加之超劑量使用和錯誤使用，易導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，嚴(yán)重影響了六神丸的用藥安全性[1]。因此有必要深入了解有毒成分與不良反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。六神丸中的雄黃，主要化學(xué)組成是As2S2。砷作為有毒的非金屬元素，以不同形態(tài)廣泛地存在于自然界中，主要包括砷酸(AsⅤ)、亞砷酸(AsⅢ)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷膽堿(AsC)等。研究表明，亞砷酸鹽、砷酸鹽的毒性較大，而有機(jī)砷的毒性相對較小[2]。因此在研究砷的藥效和毒性時，不僅要測定總砷含量，更要進(jìn)一步測定砷的化學(xué)形態(tài)，以了解砷在體內(nèi)的形態(tài)轉(zhuǎn)變及在組織中蓄積的情況。

目前砷形態(tài)分析方法主要有高效液相-電感耦合-等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)、高效液相-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)等。砷形態(tài)研究方法主要用于食品、環(huán)境、藥物、礦物等領(lǐng)域，以研究有毒元素砷的污染、溶出度、毒性和代謝等[3～6]。特別是在中藥領(lǐng)域，主要研究非含砷中藥材中的砷污染情況、含砷中藥及其復(fù)方如雄黃、牛黃解毒片、六神丸等的安全性評價及其對癌癥等疾病的治療作用等[7]。目前國內(nèi)對砷的研究多集中在單味藥材雄黃上，而對含砷復(fù)方的研究還很少。張慶麗等報道了Beagle犬口服雄黃和六神丸后血液中總砷的毒代動力學(xué)情況和曲線峰值點血漿中的砷形態(tài)[8]。此外還研究了Beagle犬口服不同劑量的雄黃和六神丸經(jīng)過28 d服藥期和14 d恢復(fù)期后，組織中總砷和各形態(tài)砷的分布情況[9]。吳倩和王啟錚等分別考察了六神丸中可溶性砷的溶出情況，發(fā)現(xiàn)六神丸經(jīng)復(fù)方配伍后，能顯著降低雄黃中可溶性砷的溶出[10-11]。王啟錚等還研究了六神丸和雄黃在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)，發(fā)現(xiàn)六神丸組大鼠全血中砷的MRT較雄黃組明顯縮短，砷更易消除，血漿中總砷濃度更低[12]。應(yīng)該看到，目前國內(nèi)關(guān)于六神丸中有毒元素砷的系統(tǒng)性研究還比較少，而且在研究中還存在許多問題,如砷元素的提取溶劑的選擇；采用高效液相分離不同砷形態(tài)時，流動相的種類、pH值和色譜柱等會影響不同形態(tài)的分離度；分析方法的局限性會影響到導(dǎo)致某些形態(tài)無法測出等。

本研究采用經(jīng)典的高效液相色譜法，用單根陰離子交換柱等度洗脫，結(jié)合原子熒光光譜法建立了大鼠肝組織中砷形態(tài)的HPLC-HG-AFS分析方法。從砷形態(tài)分析方面探討了大鼠服用不同劑量的六神丸后，肝組織中各形態(tài)砷的分布情況。同時比較了細(xì)胞破碎法與超聲法兩種砷形態(tài)提取方法對提取效率的影響，并進(jìn)行了優(yōu)化,從而為六神丸用藥的安全性和減毒機(jī)理提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SA-10型原子熒光形態(tài)分析儀(北京吉天儀器有限公司)；配有砷空心陰極燈(HAF-2)；HamiltonPRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)和HamiltonPRP-X 100保護(hù)柱(25 mm×2.3 mm,12～20 μm)；超純水機(jī)；超聲機(jī)；細(xì)胞粉碎機(jī)；離心機(jī)；制冰機(jī)。

砷酸、亞砷酸、一甲基砷、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(中國計量科學(xué)研究院)，磷酸氫二氨、硼氫化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、甲酸均為分析純，超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以砷含量計，分別稱取一定重量范圍內(nèi)的砷酸根AsV、一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、亞砷酸根AsⅢ標(biāo)準(zhǔn)品原液，加超純水配制成濃度為5、5、10、10 μg/mL的單標(biāo)。再從中取一定量配成濃度為50 ng/mL的混標(biāo)母液，稀釋獲得40、30、20、10、5 ng/mL混標(biāo)液，-20 ℃保存。臨用前渦旋1 min，置于4 ℃。

1.2.2 樣品預(yù)處理

樣本前處理：將給予不同濃度藥物的大鼠肝臟液氮研磨，裝EP管中，待用。

砷形態(tài)提取方法：目前用于砷形態(tài)分析的主要提取溶劑分別為水、水-3%乙酸(19∶1)、甲醇-水(1∶1)。水作為提取介質(zhì)，多應(yīng)用于脂肪含量較少的物質(zhì)；若以甲醇-水進(jìn)行提取，則需要濃縮或氮吹去除甲醇，且過程中易導(dǎo)致三價砷氧化，回收率偏低。水-乙酸法相對簡單，操作易行，故選取水-乙酸作為提取溶劑。采用的提取方法為超聲法，另外選取細(xì)胞破碎法作為對照，并對比兩種提取方法對大鼠肝臟中加四種砷形態(tài)混標(biāo)液的提取效率。

超聲法：準(zhǔn)確稱取10 mg肝臟組織加入0.3 mL 200 ng/mL混標(biāo)，再加入0.7 mL乙酸-水(100∶1)冰浴超聲1 h，提取液在 14 000 r/min 下離心10 min，上清置于2 mL離心管中。向組織中再加入0.5 mL乙酸-水，冰浴超聲0.5 h，離心混合上清液。重復(fù)一次，所有上清液再次離心30 min，過0.22 μm水膜。

細(xì)胞破碎法：準(zhǔn)確稱取10 mg肝臟組織加入0.3 mL 200 ng/mL混標(biāo)，再加入0.7 mL乙酸-水(100∶1)冰浴細(xì)胞粉碎3 min，提取液在 14 000 r/min 下離心10 min，上清置于2 mL離心管中。向組織中再加入0.5 mL乙酸-水，冰浴超聲0.5 h，離心混合上清液。重復(fù)一次，所有上清液再次離心30 min，過0.22 μm水膜。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

采用HPLC-HG-AFS法測定砷的形態(tài)，優(yōu)化后的檢測條件如下：流動相17.5 mmol/L磷酸氫二胺，甲酸調(diào)pH=5.9，等度洗脫；還原劑為1.5% KBH4+0.5% KOH；載流為5 %鹽酸；屏蔽氣流速800 mL/min；載氣Ar流速500 mL/min；光電倍增管電壓270 V；燈電流為100 mA。

2.2 色譜分離情況

采用HamiltonPRP-X 100色譜柱，在12 min內(nèi)對四種砷形態(tài)的混標(biāo)液(30 ng/mL)進(jìn)行等度色譜分離。由圖1可見，各物質(zhì)均達(dá)到基線分離，AsⅢ、DMA、MMA、AsV出峰時間分別為2.97、4.01、6.12、11.68 min。AsⅢ的pKa值9.22，在pH=5.9時以H3AsO3形式存在，與離子交換柱無結(jié)合，保留時間即為液相的死體積。

圖1 四種砷形態(tài)色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限

分別配制了5、10、15、30、40、50 ng/mL,共六種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實驗條件下進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在5～50 ng/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，如表1所示。空跑30 min，對比標(biāo)準(zhǔn)溶液，得出各物質(zhì)檢測限(3倍信噪比)0.46、0.40、0.38、0.69 ng/mL，定量限(10倍信噪比)1.53、1.33、1.27、2.30 ng/mL。

表1 四種砷形態(tài)的線性范圍、檢測限與定量限

2.4 精密度

配制40 ng/mL的4種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣3針，測得AsⅢ的RSD為18.42%，DMA的RSD為2.59%，MMA的RSD為5.12%，AsV的RSD為1.34%。

2.5 重復(fù)性

取相同量空白樣本3份，加相同量的混標(biāo)液，以超聲法進(jìn)行提取。按前述色譜條件進(jìn)行測定，得到AsⅢ的RSD為15.03%，DMA的RSD為3.22%，MMA的RSD為4.24%，AsV的RSD為17.93%。結(jié)果表明在基質(zhì)復(fù)雜體系中，AsⅢ和AsV的RSD達(dá)到了15%。根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，在基質(zhì)復(fù)雜、含量低于0.01%及多成分等分析中，重復(fù)性可適當(dāng)放寬[13]。故RSD值仍然在藥典可接受的范圍內(nèi)。

2.6 加標(biāo)回收率

精密稱取0.01 g正常組肝臟樣品，向其中加入30 ng四種形態(tài)砷混合標(biāo)液，做3份平行樣。按上述兩種不同方法制備，根據(jù)前述色譜條件測定含量，計算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種不同形態(tài)的砷，超聲提取比細(xì)胞破碎提取率高，可能與提取時間和溫度有關(guān)，也可能與砷形態(tài)在組織上的吸附有關(guān)。按照2015版《中華人民共和國藥典》中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分分析中，若待測定成分含量在10 ng/g時，回收率限度可適當(dāng)放寬[13]。

2.7 大鼠肝臟中砷形態(tài)分析結(jié)果

采用上述條件對給藥六神丸高劑量(給藥2個月)、六神丸高劑量(給藥1個月)、六神丸低劑量(給藥1個月)以及正常組的大鼠肝臟樣品進(jìn)行砷形態(tài)分析。結(jié)果見表3，六神丸低劑量組大鼠肝組織中砷形態(tài)色譜圖見圖2。數(shù)據(jù)表明大鼠空白肝組織中含有微量二甲基砷，大鼠灌胃給藥后肝臟中主要砷形態(tài)化合物也為DMA，但含量明顯增大。說明六神丸中的雄黃經(jīng)配伍后，所含無機(jī)砷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)砷-二甲基砷DMA。在給藥劑量一定的條件下，隨給藥時間延長，DMA含量明顯增加，說明長時間給藥大鼠肝臟中會產(chǎn)生砷的蓄積。六神丸高劑量組(給藥2個月)的DMA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于DMA的半數(shù)致死量(LD50，1 350 mg/kg)，故六神丸中的雄黃不影響其使用的安全性。

表2 兩種提取方法對應(yīng)的四種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率

表3 大鼠肝組織中砷形態(tài)的測定結(jié)果(μg/g)

圖2 六神丸低劑量組肝組織中砷形態(tài)色譜圖

3 結(jié)論

本實驗以乙酸-水為提取溶劑，采用超聲和細(xì)胞破碎對大鼠肝臟組織進(jìn)行處理，離心取上清，重復(fù)提取3次，合并上清液，并過水膜。通過HPLC-HG-AFS法測定了大鼠肝組織中砷的形態(tài)。結(jié)果表明(NH4)2HPO4濃度為17.5 mmol/L、pH為5.89時則能很好分離，且四種不同形態(tài)的砷最短在約12 min內(nèi)可以完整出峰。氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀系統(tǒng)中的載氣和屏蔽氣的流速可以通過影響基峰間接影響峰強(qiáng)度。實驗發(fā)現(xiàn)載氣流速為500 mL/min，屏蔽氣為800 mL/min時，出峰狀態(tài)最佳。最終建立了大鼠肝臟組織中四種砷形態(tài)的高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜測定法，實現(xiàn)了四種不同砷形態(tài)快速、準(zhǔn)確地分離。四種砷形態(tài)化合物的線性范圍為5～50 ng/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99，檢出限為0.3～0.7 ng/mL，RSD<20%，加樣回收率60%～160%。

采用該方法測定了灌胃給予不同劑量六神丸的大鼠肝臟組織中的砷形態(tài)，發(fā)現(xiàn)肝臟組織中只存在二甲基砷DMA，其他形態(tài)的砷未檢出?？瞻赘谓M織中也含有微量的二甲基砷，給藥大鼠肝組織中的二甲基砷含量更高。隨著給藥時間的延長，肝臟組織中的DMA含量顯著增加，說明砷在肝臟組織中產(chǎn)生了蓄積，且蓄積量與時間呈正相關(guān)。研究表明了六神丸經(jīng)肝臟代謝后，原復(fù)方中毒性較大的無機(jī)砷轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的二甲基砷；六神丸中雄黃不會影響其使用的安全性。