環(huán)狀RNA在乳腺癌中的研究進(jìn)展

劉晶晶，周冬冬，張瑾

環(huán)狀RNA（circular RNAs,circRNAs）于1976年通過電子顯微鏡在RNA病毒中首次被發(fā)現(xiàn)。隨后，在真核生物中也清晰地觀察到了circRNA的結(jié)構(gòu)［1］。與線性RNA結(jié)構(gòu)不同，circRNA是單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無5'帽端和3'尾端［2］。在過去的30年里，這些circRNA被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接或前體mRNA加工過程中的副產(chǎn)物。在不同的生物體中，也只有少量circRNA被發(fā)現(xiàn)［3］。然而，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，以及針對circRNA檢測和量化的特定方法的發(fā)展，circRNA作為一種新興的非編碼RNA被推到了聚光燈下，大量circRNA已被成功識別。研究表明circRNA廣泛參與了細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育和凋亡在內(nèi)的病理生理過程，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)［4］。這為我們提供了腫瘤研究的新方向。

1 circRNA概述

1.1 circRNA分類及其形成機(jī)制 circRNA是一類不具有5'末端帽結(jié)構(gòu)和3'末端polyA尾結(jié)構(gòu)，并以共價(jià)鍵的形式形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的特殊RNA分子。具體來說，環(huán)狀是借助套索結(jié)構(gòu)或內(nèi)含子的互補(bǔ)配對，以反向剪切的方式來形成的［5］。根據(jù)circRNA的來源可分為3類：外顯子 circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、內(nèi)含子 circRNA（intronic circRNA，ciRNA）以及由外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA（exonintron circular RNAs，EIciRNA）［6-7］。circRNA的產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，主要有套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化、內(nèi)含子配對驅(qū)動(dòng)的環(huán)化形成的外顯子circRNA，內(nèi)含子獨(dú)立環(huán)化、內(nèi)含子RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）或轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)的環(huán)化形成的內(nèi)含子circRNA等機(jī)制［8］。目前circRNA的產(chǎn)生機(jī)制仍在不斷探索中。

1.2 circRNA的特性

1.2.1 保守性 大多數(shù)circRNA中的一些序列在進(jìn)化上是保守的。作為非編碼RNA的一種，circRNA保留了相似的RNA結(jié)構(gòu)。circRNA主要特點(diǎn)是以1個(gè)2'，5'-磷酸二酯鍵使首尾相連，而競爭性內(nèi)源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）則以1個(gè)3'，5'-磷酸二酯鍵連接首尾兩端。這種特殊的反式剪接具有高度的保守性［9］。circRNA的保守核苷酸序列豐度明顯增加。通過自身的miRNA應(yīng)答元件（MicroRNA response element，MRE）競爭性結(jié)合同一miRNA，與其他具有MRE的ceRNA［假基因轉(zhuǎn)錄本、長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）和mRNA等］相比，circRNA因其特殊結(jié)構(gòu)而具有的穩(wěn)定性使其成為一種優(yōu)勢ceRNA［10］。

1.2.2 穩(wěn)定性 多數(shù)circRNA可以在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在。這種穩(wěn)定性可能是由于circRNA缺乏與mRNA類似的5'帽和3'尾端結(jié)構(gòu)，從而避免了脫腺苷化、脫帽等降解反應(yīng)［11］。

1.2.3 豐富性 circRNA在生物體中廣泛存在和表達(dá)，也存在于人體多種體液中，如血漿［12］、唾液［13］以及外泌體等［14］。

1.2.4 特異性 不同細(xì)胞、組織在不同發(fā)育階段具有circRNA特異表達(dá)譜，這種表達(dá)的特異性提示不同的circRNA具有特定功能。

1.3 circRNA的生物學(xué)功能 雖然關(guān)于circRNA參與調(diào)控生物學(xué)功能的機(jī)制尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明其參與了一系列的病理生理過程。

1.3.1 miRNA海綿樣作用 CircRNA含有大量不同類型的miRNA反應(yīng)元件，可以與miRNA相互作用，在細(xì)胞中充當(dāng)miRNA海綿、消除miRNA對其靶基因的抑制作用，這種抑制能力稱為miRNA海綿作用。CDR1as，即ciRS-7，包含70多個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)，在人類和小鼠的大腦中高度表達(dá)，首次報(bào)道其功能即是作為miR-7的海綿發(fā)揮作用［9］。另外一種circRNA——Sry（sex-determining region Y）被報(bào)道可作為miR-138的海綿，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。以上研究結(jié)果表明，circRNA可以作為miRNA海綿參與腫瘤的調(diào)控。

1.3.2 circRNA與蛋白結(jié)合 CircRNA可以直接或通過RNA與蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合，也可以作為競爭分子阻斷蛋白質(zhì)與靶分子的結(jié)合［16］。circRNA與蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)例子是circFoxo3。CircFoxo3優(yōu)先在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，可以與抗衰老蛋白質(zhì)分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、轉(zhuǎn)錄因子E2F1（E2F1基因編碼的、與細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子）和抗應(yīng)激蛋白局部黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/HIF1α結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合體滯留在細(xì)胞質(zhì)中，阻止ID1 E2F1-FAK/HIF1α的核易位，從而抑制心肌細(xì)胞的抗衰老和抗應(yīng)激功能［17］。

1.3.3 circRNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄 雖然大多數(shù)circRNA作為miRNA海綿調(diào)控miRNA，但也有一些circRNA可以順式或反式調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)的circRNA被敲除后，其對microRNA靶點(diǎn)的富集減少，這也導(dǎo)致了它們的親本基因表達(dá)減少；例如ci-ankrd52和ci-sirt7通過與PolⅡ相互作用，可以作為親本基因轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控因子，這說明內(nèi)含子circRNA可以調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄［6］。

1.3.4 circRNA參與蛋白質(zhì)的翻譯 大多數(shù)研究人員認(rèn)為circRNA是一類獨(dú)特的內(nèi)源性非編碼RNA，不能翻譯蛋白質(zhì)。然而，考慮到大多數(shù)circRNA是由編碼基因產(chǎn)生的，并且包含完整的外顯子，一些circRNA被證明有潛力被翻譯成蛋白質(zhì)。研究人員在大腸桿菌中轉(zhuǎn)染插入了綠色熒光蛋白開放閱讀框的人工circRNA，可以使大腸桿菌產(chǎn)生極長的蛋白鏈［18］。此外，Legnini等［19］研究發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609可以翻譯小鼠成肌細(xì)胞中的蛋白?？傊壳耙延凶C據(jù)證明circRNA可以直接翻譯蛋白質(zhì)。

2 circRNA在乳腺癌中的研究進(jìn)展

早期研究表明，circRNA在許多癌組織中均有差異表達(dá)，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤組織中已發(fā)現(xiàn)大量circRNA，提示circRNA可能被應(yīng)用于乳腺癌的診斷和治療。

2.1 circRNA在乳腺癌中的表達(dá) 越來越多的證據(jù)表明，在正常乳腺組織中檢測到的circRNA數(shù)量高于腫瘤組織。在最近的一項(xiàng)研究中，研究人員篩選了乳腺癌和鄰近正常組織中的circRNA表達(dá)譜，circRNA微陣列分析結(jié)果顯示，1 155個(gè)差異表達(dá)circRNA中715個(gè)上調(diào)，440個(gè)下調(diào)，證明了hsa_circ_103110、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821水平在乳腺癌組織中升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697水平在乳腺癌組織中降低［20］。Nair等［21］開發(fā)了Circ-Seq工作流程，以識別乳腺腫瘤樣本特異性的circRNA，并編制3種乳腺癌亞型中獨(dú)特的circRNA：三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）、雌激素受體陽性（ER+）和ErbB2過表達(dá)HER2陽性（HER2+）乳腺癌；值得注意的是，與來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的鄰近正常乳腺組織以及來自基因型組織（GTEx）的正常乳腺組織樣品相比，在乳腺腫瘤中觀察到較少數(shù)量的circRNA表達(dá)；此外，此項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)ER+乳腺癌癌旁正常組織中的circRNA與增殖基因的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增殖（ROR-P）評分呈負(fù)相關(guān)，提示circRNA可能是乳腺癌和相關(guān)細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。

2.2 circRNA與乳腺癌的增殖和進(jìn)展

2.2.1 circRNA通過microRNA海綿調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖和進(jìn)展 越來越多的證據(jù)證明，microRNA在腫瘤發(fā)生過程中調(diào)控基因表達(dá)。深入研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNA作為microRNA海綿參與調(diào)控腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。Tang等［22］研究發(fā)現(xiàn)circRNA hsa_circ_0001982在乳腺癌組織和細(xì)胞系中明顯過表達(dá)，其通過靶向miR-143發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）的作用；敲低hsa_circ_0001982可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究探討了circRNA的ceRNA機(jī)制在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為基礎(chǔ)研究提供了新的視角。

有研究報(bào)道，circGFRA1在乳腺癌中上調(diào)表達(dá)，并與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級呈正相關(guān)；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，circGFRA1可能作為miR-34a海綿通過ceRNA機(jī)制起到調(diào)節(jié)GFRA1表達(dá)的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制TNBC的凋亡［23］。上述研究證明circRNA可通過miRNA海綿作用隔離與增殖相關(guān)的特定miRNA，從而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

2.2.2 circRNA通過癌癥相關(guān)的信號通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展 乳腺癌細(xì)胞增殖與多種癌癥相關(guān)信號通路的異常激活有關(guān)。研究表明，circRNA通過直接調(diào)控靶基因或與癌癥相關(guān)信號通路密切相關(guān)的miRNA相互作用，在乳腺癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。最近一項(xiàng)研究表明，hsa_circ_0011946/復(fù) 制 因 子 C3（Replication factor，RFC3）信號通路的失活可能抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力［24］。miR-7作為一種抑癌miRNA，在乳腺癌組織中的表達(dá)低于正常乳腺組織，在侵襲性乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-7可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［25］。目前，miR-7已被證實(shí)可通過直接下調(diào)表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）［26］、紅系 Kruppel樣因子（Kruppel like factor，KLF4）［27］、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 SETDB1［28］等關(guān)鍵促癌因子的表達(dá)參與許多癌癥相關(guān)的信號通路，這些研究表明miR-7具有明顯的抑癌作用。Zhang等［28］證明miR-7通過直接抑制致癌基因SETDB1的表達(dá)，從而阻斷STAT3信號通路，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，部分逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）；該研究還發(fā)現(xiàn)ciRS-7可能作為miR-7的競爭性circRNA減弱miR-7對STAT3通路的抑制。綜上所述，新發(fā)現(xiàn)的ciRS-7作為一種抑制miR-7的circRNA，參與了許多癌癥相關(guān)的信號通路。

2.3 circRNA與乳腺癌的診斷與預(yù)后 預(yù)后評估對預(yù)后不良因素的早期干預(yù)和癌癥患者預(yù)期壽命的延長具有重要意義。近年來研究表明，circRNA參與了乳腺癌的多種病理過程。探索circRNA作為乳腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要臨床意義和價(jià)值。例如，乳腺癌患者術(shù)后血漿hsa_circ_0001785水平較術(shù)前明顯降低，提示其可作為判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物［29］。這種現(xiàn)象可能主要是由于乳腺癌切除后腫瘤源性核酸的釋放減少引起的［30］。而且血漿中hsa_circ_0001785的水平還與乳腺癌的組織學(xué)分級、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，從而利用has-circ-0001785在不同分期乳腺癌組織中表達(dá)水平的差異進(jìn)一步對乳腺癌進(jìn)行細(xì)化分期分級。此外，有報(bào)道稱circGFRA1在乳腺癌組織中上調(diào)，與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNBC的組織學(xué)分級呈正相關(guān)［23］。以上研究證明circRNA在乳腺癌的診斷和預(yù)后方面具有較好的應(yīng)用前景。

2.4 circRNA與乳腺癌化療耐藥的關(guān)系 circRNA不僅與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，而且與乳腺癌化療的不良反應(yīng)及耐藥產(chǎn)生也有著密切的聯(lián)系。化療是治療乳腺癌的有效臨床策略，但有時(shí)因?yàn)樗幬锬退帉?dǎo)致療效降低，從而導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和較差的預(yù)后。探索化療耐藥產(chǎn)生機(jī)制中涉及的分子途徑至關(guān)重要。例如，Gao等［31］在阿霉素耐藥的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系和其親代細(xì)胞中篩選出了18個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中hsa_circ_00006528在阿霉素耐藥細(xì)胞中的表達(dá)相對阿霉素敏感細(xì)胞系更高；此外，還進(jìn)一步揭示了hsa_circ_00006528-miR-7-5p-Raf1反應(yīng)軸在乳腺癌耐藥相關(guān)機(jī)制中的作用，揭示了hsa_circ_00006528克服阿霉素耐藥性的可能性。此外，Miao等［32］證明了 miR-130b 靶向PTEN通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)多藥耐藥；考慮到circRNA的生物學(xué)功能，某些circRNA可能充當(dāng)miR-130b的海綿，與PI3K/Akt信號通路中相關(guān)靶基因作用參與乳腺癌的化療耐藥。鑒于circRNA與乳腺癌耐藥的關(guān)系，分析circRNA的異常表達(dá)對于乳腺癌的進(jìn)一步治療至關(guān)重要。

2.5 circRNA與乳腺癌的靶向治療 CircRNA具有潛在的抗癌作用，目前已有大量的circRNA被證實(shí)與乳腺癌的增殖和進(jìn)展有關(guān)，顯示了其作為乳腺癌治療靶點(diǎn)的潛在作用。Wang等［33］研究表明，circRNA-000911在乳腺癌中通過對miR-449的海綿樣作用，從而激活Notch1和核因子（NF）-κB信號通路，發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。因此，circRNA-000911可能為乳腺癌的新治療策略的制定提供了一個(gè)新的方向。此外，研究報(bào)道circ-Foxo3可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制乳腺癌進(jìn)展，因此其有望成為一種新的乳腺癌治療靶點(diǎn)［34］。目前，研究表明腫瘤干細(xì)胞對腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用［35］。傳統(tǒng)治療方法最終失敗的原因可以歸結(jié)為沒有殺死腫瘤干細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。為了預(yù)防乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，根除乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cells BCSCs）至關(guān)重要。Yan 等［36］使用RNA測序技術(shù)篩選了BCSCs中的circRNA譜，發(fā)現(xiàn)27個(gè)circRNA表達(dá)異常，其中19個(gè)表達(dá)下調(diào)，8個(gè)表達(dá)上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)circVRK1可以抑制乳腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)張和自我更新能力。此項(xiàng)研究結(jié)果表明circVRK1可能是乳腺癌的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

目前，有幾種技術(shù)為部分或完全去除致癌circRNA提供了前所未有的機(jī)會，包括基于siRNA的治療［37］、反義寡核苷酸治療［38］、CRISPER/Cas系統(tǒng)［39］等。相反，以往的研究表明，參與癌癥的miRNA可以分為促癌miRNA和抑癌miRNA。前者可以通過miRNA海綿的功能或其他途徑被circRNA所抑制。由于某些circRNA對特定的miRNA具有許多結(jié)合位點(diǎn)，因此它們比典型的miRNA抑制劑更有效。此外。有研究表明，細(xì)胞外囊泡很有可能可以有效地將circRNA傳遞到準(zhǔn)確的作用位點(diǎn)［40］。

3 展望

circRNA曾被認(rèn)為是mRNA錯(cuò)誤剪接形成的副產(chǎn)物，現(xiàn)在被認(rèn)為是RNA領(lǐng)域中一個(gè)新興的關(guān)鍵分子。circRNA分子具有miRNA海綿樣作用、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯、作為生物標(biāo)志物以及抑癌因子等一系列功能，被認(rèn)為是各種生理和病理生理過程中的重要調(diào)控因子。近年來，諸多研究探索了circRNA在癌癥中的臨床價(jià)值。本文介紹了circRNA參與乳腺癌的增殖、遷移、侵襲和凋亡等多種生物學(xué)過程，其作為在乳腺癌診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)和風(fēng)險(xiǎn)評估等方面有前景的生物標(biāo)志物，是潛在的治療靶點(diǎn)。總之，circRNA為乳腺癌的診斷和治療提供了一個(gè)新的視角。然而，與編碼RNA、miRNA和lncRNA相比，目前我們對circRNA的認(rèn)識還比較淺顯，大多數(shù)circRNA的生理和病理過程中的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步的研究來揭示，以便在未來應(yīng)用于臨床。