血清HBeAg定量檢測技術(shù)新進(jìn)展

陳秀麗 張學(xué)東 戴二黑★

近年來，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的實(shí)驗(yàn)室檢測方法不斷涌現(xiàn)和更新，HBV DNA、HBV RNA、HBV 共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular，cccDNA）定量檢測、HBV 基因型與基因突變位點(diǎn)檢測、乙型肝炎核心相關(guān)抗原（hepatitis B core-related HBcrAg）檢測方法相繼問世并在臨床逐漸推廣應(yīng)用。HBV 血清標(biāo)志物包括乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）、HBeAg（hepatitis B e Antigen，HBeAg）、乙型肝炎e 抗體（hepatitis B e antibody，抗-HBe）、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，抗-HBc），亦稱乙肝五項，由以往的定性檢測發(fā)展為定量檢測，賦予了乙肝五項新的內(nèi)涵，逐漸被臨床所認(rèn)識。本文對血清HBeAg定量檢測技術(shù)進(jìn)展，血清HBeAg定量與HBV 復(fù)制、肝組織損傷、病情進(jìn)展以及抗病毒治療中的評估作用等方面進(jìn)行綜述。

1 血清HBeAg定量檢測技術(shù)的進(jìn)展

截止目前，在乙肝五項檢測中，國外進(jìn)口化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)僅能對HBsAg和抗-HBs 進(jìn)行定量檢測，美國雅培（architec）公司檢測的樣品吸光度比臨界值（sample absorbance/cut off，S/CO），瑞士羅氏（elecsys）公司檢測樣本的臨界值指數(shù)（cut off index，COI），均為血清HBeAg 檢測“半定量”結(jié)果，由于沒有溯源標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果難以進(jìn)行比較。如果以HBeAg定量參考物質(zhì)作為定值標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)HBeAg 的絕對定量。由于沒有全球通用的參考物質(zhì)，目前絕大部分研究采用德國Paul-Ehlich Institute 提供的HBeAg 參考物質(zhì)，單位為PEIU/mL。有學(xué)者自建了雅培微粒子酶免分析系統(tǒng)血清HBeAg定量檢測方法，這種方法檢測范圍為0.15～200 PEIU/mL，也可以用胎牛血清對標(biāo)本稀釋后進(jìn)行檢測[1]。此外，還有學(xué)者提供了羅氏Elecsys 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換公式，即HBeAg（PEIU/mL）=COI 樣本×0.222，此公式可對結(jié)果為1～1000 COI 的HBeAg 進(jìn)行定量，超過1 000 者可用陰性血清1∶40 稀釋后再檢測[2]。近年來，國內(nèi)生產(chǎn)廠家在化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的研發(fā)方面，實(shí)現(xiàn)了對乙肝五項全定量檢測，為血清HBeAg 等指標(biāo)定量檢測提供了可靠的技術(shù)保障。

2 血清HBeAg定量測定的臨床意義

2.1 血清HBeAg定量與HBV 復(fù)制的關(guān)系

HBV 自然史研究表明，免疫耐受期（immunetolerant，IT）HBV 復(fù)制活躍，Chen 等[3]報道慢性HBV 攜帶者血清HBV DNA與HBeAg定量變化規(guī)律呈現(xiàn)一致，血清HBeAg 水平范圍很大，相差3個數(shù)量級，高水平HBeAg 能有效提示高水平HBV DNA，S/CO為768 的患者中，94%患者血清HBV DNA ＞2107 copies/mL。肝組織HBV cccDNA 較血清HBV DNA 更能準(zhǔn)確反映被感染細(xì)胞的數(shù)量，Thompson 等[4]報 道HBeAg 定 量與 血清HBV DNA、HBsAg 以及肝組織HBV DNA水平顯著相關(guān)，但是，與肝組織HBV cccDNA 含量的相關(guān)系數(shù)為0.400 1（P=0.111 5）。張琳等[5]發(fā)現(xiàn)HBV 攜帶者肝組織HBV cccDNA 含量為（5.66±0.93）log 拷貝/mg，血清HBeAg定量為（1 065.80±679.84）PEIU/mL，兩者之間無相關(guān)性（r=0.152，P＞0.05）。然而，李春艷等[6]證實(shí)肝組織HBV cccDNA 含量與血清HBeAg 水平顯著相關(guān)（r=0.676，P＜0.01）。納入的研究對象不同，檢測方法不統(tǒng)一等因素可能是研究結(jié)果不一致的原因，李春艷等[6]采用時間分辨熒光免疫分析法，而其他研究均為化學(xué)發(fā)光免疫分析法。另外，研究結(jié)果也可能與HBV 前-C（pre-C）/基本核心啟動子（Basal Core Promoter，BCP）突變以及研究人群的基因型不同有關(guān)，血清HBeAg與病毒復(fù)制等指標(biāo)的關(guān)系非常復(fù)雜，取決于病毒和宿主免疫相互作用的結(jié)果。因此，血清HBeAg與肝組織HBV cccDNA 含量的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

2.2 PC/BCP 突變對血清HBeAg定量的影響

HBeAg 可誘導(dǎo)免疫耐受，因而HBeAg 的減少可能和免疫耐受打破有關(guān)。HBV 前-C 區(qū)ntG1896A 點(diǎn)突變，可以導(dǎo)致第28位氨基酸（aa28）由色氨酸TGG 變?yōu)榻K止密碼TAG，能阻斷HBeAg的合成，從而造成HBeAg 轉(zhuǎn)陰而抗-HBe 陽轉(zhuǎn)[7]，而且，1896 變異的發(fā)生具有HBV 基因型依賴性：B～E 基因型的G1896與T1858 配對所形成的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，nt1896 的G 變異為A 使結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定；而A和F 基因型的nt1858 是C，與G1896組成較穩(wěn)定的C-G 對，故很少發(fā)生前C 區(qū)ntG1896A 變異。HBeAg 及其前體翻譯自3.5 kb 的前C mRNA，而BCP 調(diào)節(jié)該mRNA的轉(zhuǎn)錄。BCP 變異會降低前C mRNA的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)而影響HBeAg 前體的表達(dá)，造成HBeAg 陰性血清表現(xiàn)型的HBV 感染[8]。

B 基因型與C 基因型相比，B 基因型易發(fā)生PC 突變，而C 基因型易發(fā)生BCP 突變。有研究證實(shí)HBeAg 陽性慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者中，PC/BCP 突變患者血清HBV DNA水平明顯低于野生型患者[9-11]。Thompson 等[4]發(fā)現(xiàn)在61例HBeAg 陽性CHB 患者中，野生型僅有27例，PC 突變、BCP 突變、PC/BCP 同時突變者分別為10、22、2例，PC/BCP 突變患者血清HBeAg 水平明顯低于野生型患者。用血清HBV DNA 校準(zhǔn)后這種差異依然存在，提示由于基因突變而并非HBV DNA 復(fù)制的抑制造成HBeAg 水平降低。因此，PC/BCP 突變株的出現(xiàn)是造成血清HBeAg定量水平降低甚至陰性的原因之一。

2.3 基線血清HBeAg定量與HBeAg 自發(fā)清除密切相關(guān)

圍生期HBV 感染者的HBeAg 自發(fā)消失率很低，HBeAg/抗-HBe 自發(fā)血清學(xué)轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)在免疫清除期（immune-clearance，IC），年發(fā)生率約為2%～15%，HBeAg 陰轉(zhuǎn)或者HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者每年只有約1%發(fā)展為肝硬化，并且在HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，HBsAg年清除率約為0.5%～1%，而HBeAg 未陰轉(zhuǎn)的患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）波動較小，HBV DNA 呈現(xiàn)高水平[12]。Song 等[13]報道隨訪1年時HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換比例為15.9%（18/113），28 周時HBeAg定量為1.53 log PEIU/mL 的界限值，用于確定1年時HBeAg/抗-HBe 自發(fā)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為94.4%、60.0%、30.9%、98.3%。因此，HBeAg/抗-HBe 自發(fā)血清學(xué)轉(zhuǎn)換與患者HBV 基因型、年齡、血清ALT 水平以及基線HBeAg定量水平有關(guān)。

2.4 血清HBeAg定量與肝組織損傷的關(guān)系

有研究顯示，血清ALT 水平可以反映肝細(xì)胞炎癥損傷程度，血清HBeAg定量高時，ALT水平呈現(xiàn)下降[14]。Li等[15]報道IT期患者高水平HBeAg 持續(xù)時間長，ALT 正常，肝組織學(xué)無明顯異?；蜉p度炎癥壞死及緩慢肝纖維化的進(jìn)展，IC 期機(jī)體針對HBV 免疫應(yīng)答強(qiáng)烈，被HBV 感染的肝細(xì)胞受免疫攻擊而減少，從而HBeAg 水平降低，ALT持續(xù)或間歇升高，IC 期的ALT與血清HBeAg定量水平呈負(fù)相關(guān)（β=-0.290，P=0.018）。Zeng 等[16]證實(shí)血清HBeAg定量水平與IC 期患者的肝組織炎癥分級及肝纖維化分期顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.304和0.371，（P＜0.001）。因此，血清HBeAg定量與肝組織損傷程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

2.5 血清HBeAg定量在判斷慢性HBV 感染者病情進(jìn)展中的意義

乙肝相關(guān)肝硬化、肝癌患者的HBV DNA、HBeAg 水平較慢性乙型肝炎患者降低，提示血清HBV DNA、HBeAg 水平與乙型肝炎疾病的進(jìn)展程度呈負(fù)相關(guān)。IT 患者HBsAg和HBeAg定量水平高，HBV DNA 通常高于200 000 IU/mL；IC 患者血清HBeAg 水平低于IT 期，多數(shù)可達(dá)到HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn) 換和HBV DNA 抑制[17]。Wang 等[18]報道IT和IC 期HBeAg 水平分別為（1317.9±332.9）S/CO和（673.4±562.1）S/CO，P＜0.001，ROC曲線分析數(shù)據(jù)顯示，HBeAg ＞1 118.96 S/CO 可以區(qū)分IT和IC 期的敏感度為85.2%，特異度為75%。因此，血清HBeAg定量可以監(jiān)測和判斷患者病情變化，以及區(qū)分自然病程的分期。

2.6 血清HBeAg定量在CHB 患者抗病毒治療中的評估作用

2.6.1 血清HBeAg定量在聚乙二醇化干擾素（Pegylated interferon，PEG-IFN）治療中的預(yù)測價值

在PEG-IFN 治療過程中進(jìn)行HBsAg和HBeAg定量檢測，可以更好地預(yù)測持久病毒學(xué)應(yīng)答甚至HBsAg 轉(zhuǎn)陰或血清轉(zhuǎn)換?；€特征指導(dǎo)治療（baseline-guided-therapy，BGT）策略可以識別干擾素治療的優(yōu)勢患者，基線HBeAg定量可以預(yù)測患者抗HBV 治療效果，從而優(yōu)化治療方案。Fried等[19]報道PEG-IFN 治療48 周的HBeAg 陽性CHB患者，基線HBeAg＜31 PEIU/mL、HBeAg 31～1 294 PEIU/mL、HBeAg＞1 294 PEIU/mL 3組患者在治療結(jié)束時，HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率分別為54%、26%、24%（P＜0.001，95% Cl 1.33～2.4）。應(yīng)答指導(dǎo)治療（reponse-guided-therapy，RGT）策略根據(jù)PEG-IFN 治療早期（12 周或24 周）的應(yīng)答情況，預(yù)測停藥后持久應(yīng)答，指導(dǎo)治療方案的調(diào)整。Tangkijvanich 等[20]報道PEG-IFN 治療24 周時，HBeAg下降大于2.0 log，是預(yù)測1年內(nèi)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答和HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的界限值，敏感性和陰性預(yù)測值分別為85%和92%。一項亞洲研究證實(shí)，PEG-IFN 治療12 周或24 周時檢測HBeAg定量，對HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換同樣具有良好的預(yù)測價值[21]。因此，在治療前及治療過程中密切監(jiān)測HBeAg定量，可早期、及時預(yù)測HBeAg 血清轉(zhuǎn)換，有助于優(yōu)化治療方案。

2.6.2 血清HBeAg定量在核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs）治療中的預(yù)測價值

NAs 能夠有效地抑制HBV 復(fù)制，但血清HBeAg/抗-HBe 轉(zhuǎn)換率不高[22]。Wong 等[23]研究發(fā)現(xiàn)替諾福韋（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）治療384 周時HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為52%，基線和治療24 周時HBeAg定量分別為1.63 log PEIU/mL和0.90 log PEIU/mL，可以預(yù)測HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換（P=0.002），并且治療24 周時HBeAg定量下降大于2.2 log與 基因A 或D型患者的HBsAg 消失相關(guān)（38%vs15%，P=0.03）。Shin 等[24]報道恩替卡韋（entecavir，ETV）治療3年的HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為31.7%。Kwon等[25]發(fā)現(xiàn)基線HBeAg定量＜360 PEIU/mL，以及治療12 周時HBeAg 下降超過1 log，可以預(yù)測治療1年的病毒學(xué)應(yīng)答和HBeAg/抗-HBe 血清學(xué)轉(zhuǎn)換。因此，在NAs 治療過程中，檢測血清HBeAg 基線水平、動態(tài)監(jiān)測治療早期某些時間點(diǎn)HBeAg 水平及下降幅度，對于預(yù)測抗病毒療效具有重要意義。

3 小結(jié)與展望

HBeAg定量檢測是近年來乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測技術(shù)的重要發(fā)展，是HBV DNA 定量檢測的補(bǔ)充，基線HBeAg定量可預(yù)測PEG-IFN和NAs的療效；治療過程中實(shí)時監(jiān)測HBeAg 降低幅度，可更加精準(zhǔn)預(yù)測抗病毒藥物療效，指導(dǎo)臨床醫(yī)師制定和優(yōu)化治療方案。全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析法是建立在信號示蹤之上的技術(shù)，檢測血清HBeAg定量，具有靈敏度高，操作簡便、快速，結(jié)果穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量寬等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床工作中值得普遍推廣。