CircRNA在婦科腫瘤中的研究進(jìn)展

郝辰珺 李智 陳彥竹 梁偉國 李艷秋★ 黃超友

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在臨床疾病診斷和生物制品的研發(fā)需求的不斷加深，研究者對腫瘤的作用機(jī)理、細(xì)胞層面、分子水平的變化進(jìn)行了深入挖掘。CircRNA 是一種非編碼RNA，其發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在機(jī)體蛋白編碼的認(rèn)知觀點(diǎn)[1]。CircRNA與傳統(tǒng)的mRNA 最大的區(qū)別在于其存在的閉環(huán)可抵抗RNA 酶的降解，這個閉環(huán)是由RNA 分子的3′和5′端的磷酸基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)而成，從而保障了CircRNA分子的穩(wěn)定性和進(jìn)化保護(hù)[2]。隨著CircRNA分子在不同生物體中不斷發(fā)現(xiàn)，研究者對其進(jìn)行了相應(yīng)的信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，截止目前國際上已經(jīng)完成了近20萬種不同CircRNA的信息庫，由此進(jìn)一步證明CircRNA 是生物界廣泛存在的，但是由于CircRNA分子的發(fā)現(xiàn)較晚導(dǎo)致目前其對各種細(xì)胞的作用機(jī)理及作用途徑了解較少。通過CircRNA分子的生物學(xué)特征及分類研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA分子廣泛參與蛋白質(zhì)的翻譯和表達(dá)，同時其還具有miRNA 海綿分子功能以及RNA 連接蛋白（RNA banding protein，RBP）功能[3]。同時大量研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA 參與了表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，對生殖干細(xì)胞定向發(fā)育以及胚胎的成熟均起到重要影響[4]。在疾病診斷上目前大量研究證實(shí)CircRNA 可以與miRNA 產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用從而影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)育、轉(zhuǎn)移及凋亡等[5]。本研究以CircRNA在婦科腫瘤中的變化為研究思路，綜合國內(nèi)外研究報(bào)道，深入總結(jié)CircRNA的生物學(xué)特征以及其對婦科腫瘤的發(fā)生及在診斷中的價(jià)值。

1 CircRNA的概述

1.1 CircRNA 簡介

CircRNA是RNA家族中發(fā)現(xiàn)的最新成員，屬于非編碼RNA，其主要存在于轉(zhuǎn)錄的拼接過程中，由單鏈RNA的3′和5′通過共價(jià)鍵連接形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此環(huán)狀共價(jià)環(huán)有效保障了CircRNA對RNA 核酸外切酶高度耐受性特性，因此相比線性RNA 更具有穩(wěn)定性。

1.2 CircRNA的來源

CircRNA主要來自于蛋白質(zhì)編碼基因，目前已經(jīng)在于人類基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、病毒及細(xì)菌中[6]。CircRNA 是tRNA和lncRNA 之間的基因間隔子或反轉(zhuǎn)錄本，其不含有線性RNA的5′和3′ 的poly（A）結(jié)構(gòu)。根據(jù)其RNA 序列的來源不同將其分為外顯子CircRNA（ecRNA）、內(nèi)含子CircRNA（ciRNA）和外顯子-內(nèi)含子CircRNA 3種，其中外顯子CircRNA 占比最高。除外顯子CircRNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中外，其余兩種均存在于細(xì)胞核中，3種CircRNA在細(xì)胞中的結(jié)合位點(diǎn)均為2′-5′磷酸二酯鍵[7]。外顯子CircRNA 除具有miRNA 海綿作用外，還起到RNA 連接蛋白RBP 作用，以調(diào)控RNA的選擇性拼接、運(yùn)輸及翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生理過程，內(nèi)含子CircRNA和外顯子-內(nèi)含子CircRNA 主要參與調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄過程[8]。

1.3 CircRNA的特征及生物學(xué)功能

CircRNA 是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，研究者對其生物學(xué)特征的研究主要通過與線性RNA 對比而獲得，目前對CircRNA的分子學(xué)特征總結(jié)主要包括：①CircRNA 主要產(chǎn)生于外顯子，且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少量參與細(xì)胞核中表達(dá)的主要為內(nèi)含子CircRNA 或其片段；②外顯子CircRNA 可參與內(nèi)生非編碼RNA的表達(dá)調(diào)控，其對RNA 轉(zhuǎn)錄前后的變化起到重要調(diào)節(jié)作用；③CircRNA 可以與miRNA 相互作用從而調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白表達(dá)；④CircRNA 具有對RNA 核酸外切酶高度耐受的共價(jià)閉環(huán)，從而保障了其結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定性，這種性質(zhì)對物種進(jìn)化過程中起到重要保護(hù)作用，這種保護(hù)作用間接決定了組織特異性；⑤CircRNA 通常被發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞外液（唾液、血液及尿液等）中，且其表達(dá)水平是線性RNA的十倍以上[9-11]。CircRNA的上述特征保障了其具有穩(wěn)定的生物學(xué)特征，因此有研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)物種中的CircRNA的半衰期比線性RNA 長近10 h 左右。

基于CircRNA的分子特征，研究者發(fā)現(xiàn)了CircRNA 許多潛在的生物學(xué)功能，主要包括：①CircRNA 起到miRNA 海綿分子功能。Hansen等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)CircRNA 含有多個可以與miRNA-138 連接的位點(diǎn)，同時有研究也進(jìn)一步證實(shí)了小腦變異蛋白（CDR1）的反義鏈CircRNA（CDR1as/CiRS-7）存在人和鼠的腦組織中，CiRS-7（circular RNA sponge for miR-7）含有73個miR-7 結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)其與miR-7 結(jié)合后可以抑制miR-7 的生物學(xué)功能，從而激活miR-7 的下游基因。Thomas B H等[14]研究發(fā)現(xiàn)SRY-CircRNA（SRY-9）可以作為miR-138 的分子海綿，而SRY-9 是小鼠Y 染色體上決定性別的基因，因此生物體中CircRNA 作為miRNA的分子海綿可能性較為普遍。同時研究者們[15]還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)CircRNA 均可作為miRNAs的分子海綿，就如miRNA 作為mRNA 一樣。②CircRNA 起到RBP 功能，RBP 主要通過對RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響細(xì)胞代謝過程（細(xì)胞增殖、分化、凋亡及衰老等），如RNA 連接蛋白circ-Foxo3 可通過與細(xì)胞蛋白依賴性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinases，CKD2）相互作用以抑制細(xì)胞周期維持在G1/S 階段[16]。由CircRNA 海綿分子通過與精氨酸蛋白（AGOP）、RNA-QKI MBL 蛋白、RNA 聚合酶Ⅱ（polⅡ）及真核啟動子4A-Ⅲ組成的RNA 蛋白復(fù)合體（RNA- protein complexes，RPCs）起到了RBP 作用，并可以與線性RNAs 結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[17]。但是，目前對CircRNA 連接蛋白調(diào)控RNA 轉(zhuǎn)錄機(jī)理尚不清楚，但是可以初步確認(rèn)cricRNA 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程主要發(fā)生于細(xì)胞核中，而其起到RNA 海綿分子作用主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。③CircRNA 可參與蛋白編碼過程。CircRNA 屬于非編碼RNA的一條鏈，當(dāng)其被插入到細(xì)胞內(nèi)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（IRES）時，就會產(chǎn)生與線性RNA 不同的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄，之后真核細(xì)胞核糖體中40s 亞基與含有IRES 的CircRNA 發(fā)生病翻譯[18]。截止目前僅發(fā)現(xiàn)病毒CircRNA 具備這種可編碼翻譯蛋白的功能，如HBV 的衛(wèi)星病毒HDV，同時這種病毒CircRNA在真核細(xì)胞中的翻譯機(jī)理尚不清楚[19]。④CircRNA 協(xié)同miRNA 參與機(jī)體不同器官細(xì)胞的生理功能調(diào)節(jié)。Chen 等[20]研究中發(fā)現(xiàn)進(jìn)行體外受精治療期間，CircRNA水平（circ103827，circ104816）與女性高質(zhì)量胚胎數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Dong 等[21]研究發(fā)現(xiàn)CircRNA水平與精子的運(yùn)動及受精也具有相關(guān)性。除上述生物學(xué)功能外，CircRNA水平也與相關(guān)疾病有一定相關(guān)性，Zhang 等[22]發(fā)現(xiàn)CircRNA101222 表達(dá)水平在子癲前期（PE）女性與正常女性之間存在顯著差異。同時，Qian等[23]發(fā)現(xiàn)PE女性和早產(chǎn)女性胎盤組織中有3種CircRNA 表達(dá)水平存在顯著差異。

1.4 CircRNA在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)理

隨著CircRNA的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)CircRNA的水平變化不僅對機(jī)體相關(guān)生理功能調(diào)節(jié)作用，同樣對腫瘤的發(fā)生及起到重要影響。大量的研究證實(shí)了CircRNA可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡。Ma 等[24]研究發(fā)現(xiàn)CircRNA-000284 可以與miR-506 作用調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲，Xing 等[25]發(fā)現(xiàn)CircRNA 可通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR 信號路徑影響腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。Liu 等[26]發(fā)現(xiàn)Circ-ZFR 可以通過調(diào)節(jié)PTEN和mir-130a/mir-107 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增，Wang 等[27]發(fā)現(xiàn)has-Circ-0014717 可以通過調(diào)節(jié)p16 的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞周期。綜合近年來研究可知，CircRNA 主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長過程中相關(guān)信號通路途徑調(diào)節(jié)促進(jìn)和抑制腫瘤的變化，但是其如何作用信號通路中特定蛋白的機(jī)理目前仍需要深入研究。

1.5 CircRNA的臨床檢測

隨著近年來深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)CircRNA 是一種普遍存在nRNA，其參與細(xì)胞中各種不同基因的表達(dá)調(diào)控，但是目前對其的研究較少且其潛在的一些功能仍未被揭露。傳統(tǒng)的CircRNA 檢測主要通過CircSeq 技術(shù)，這種方法對于低豐度CircRNA的檢測有效率較低，同時對區(qū)別反向剪接產(chǎn)生的CircRNA和細(xì)胞中本身存在的CircRNA 功能較差，隨著生物學(xué)信息技術(shù)的不斷改進(jìn)高通量測序技術(shù)有效的改善了RNA-seq 上述缺陷?；诟咄繙y序方法，目前CircRNA的測序工具也相應(yīng)增多如Mapsplice、CIRI 及CIRCexporer 等。除此之外，為便于有效探知CircRNA的功能，目前全球已建立了關(guān)于CircRNA的基因組和序列數(shù)據(jù)庫（如www.circbase.org）中包含了150 000個CircRNA的信息[28]。

2 CircRNA在婦科腫瘤疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展

婦科腫瘤是目前婦科疾病中對女性健康危害性最大的一類疾病。婦科腫瘤種類較多，包括宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等，據(jù)報(bào)道，宮頸癌和卵巢癌的致死率及發(fā)病率最高。

2.1 CircRNA與宮頸癌

Abdelmohsen 等[3]通過使用宮頸癌HeLa細(xì)胞研究證明CircPABPN1 可以競爭性的連接到HuR上，這樣就可以抑制HuR′s 的連接位點(diǎn)連接到PABPN1 mRNA 上進(jìn)行翻譯，從而抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增。Bachmayr-Heyda 等[29]發(fā)現(xiàn)在13種人類組織中CircRNA的整體峰度與腫瘤細(xì)胞增值率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，CDRIas 在宮頸癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于癌旁組織，而miR-7與其相反[30]。Lee 等[31]通過對宮頸癌的Hela和C33A細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，CDRIas 的超表達(dá)可以通過抑制miR-7 的活力而增加FAK（粘著斑激酶，miR-7 的靶標(biāo)）的表達(dá)，F(xiàn)AK 的超表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的擴(kuò)增、侵襲及遷移，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CDRIas與miR-7 在宮頸癌的調(diào)節(jié)中具有相關(guān)性。因此建立基于CDR1as 的檢測方法對宮頸癌的早期診斷具有重要作用，除此之外以CDR1as 進(jìn)行分子靶標(biāo)進(jìn)行靶向治療潛力巨大。

2.2 CircRNA與卵巢癌

卵巢癌，目前婦科腫瘤中致死率最高的疾病，其不僅影響卵巢部位卵母細(xì)胞的正常發(fā)育，同時對卵巢激素分泌也造成很大影響。Zhou 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)mRNA 上調(diào)或CircRNA 下調(diào)時，與其相關(guān)的NFkB、PI3k/AKT和TGF（這兩個含有多種miR-24/let-7 結(jié)合位點(diǎn)）就會在轉(zhuǎn)移癌中被上調(diào)。此結(jié)果說明CircRNA與mRNA在卵巢癌的發(fā)生中具有相關(guān)性，并且可以通過與卵巢細(xì)胞上miR-24/let-7結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合競爭性抑制miRNA的線性剪切和海綿功能，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移-誘發(fā)基因的表達(dá)，從而有利于卵巢癌的轉(zhuǎn)移。因此以NFkB、PI3k/AKT和TGF作為靶點(diǎn)既可以對卵巢癌的發(fā)生及進(jìn)展的監(jiān)測具有重要的指導(dǎo)作用。

2.3 CircRNA與乳腺癌

乳腺癌同樣是困擾女性健康的重要疾病。有研究發(fā)現(xiàn)CDR1as可以起到的miR-7的海綿分子作用，從而可以反向調(diào)節(jié)miR-7 活性并降低其對ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，從而反過來促進(jìn)包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)展，當(dāng)miR-671 連接到CDR1as 上，由AGO介導(dǎo)的分裂就會被啟動從而降低CDR1as 的表達(dá)水平，從而減弱CDR1as 的表達(dá)，間接調(diào)整miR-7的活性水平[33]。miR-7 的表達(dá)水平主要被其上游基因HOXD10 正向調(diào)節(jié)，其低表達(dá)水平可以提升癌癥的侵襲性能，當(dāng)PAK1 水平上升、miR-7 或HOXD10 水平下降時，乳腺癌細(xì)胞的侵襲力就會增強(qiáng)[34]。發(fā)現(xiàn)miR-7 還可靶向REGγ 抑制乳腺癌小的擴(kuò)增，同時可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[35]。因此，miR-7 的表達(dá)水平與癌癥的上皮分化密切關(guān)聯(lián)：表達(dá)水平越低，轉(zhuǎn)移潛能越弱。

Karla 等[36]發(fā)現(xiàn)miR-7 可以抑制p21 激酶的表達(dá)（PAK1），這種酶在多種腫瘤中水平均呈現(xiàn)上調(diào)，同時有研究發(fā)現(xiàn)miR-7 在哺乳動物乳腺癌組織中低水平表達(dá)，且其表達(dá)水平與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力能負(fù)相關(guān)性。Tang 等[37]發(fā)現(xiàn)作為miR-7的海綿分子，CDR1as 可以反向調(diào)節(jié)其活性并降低其對ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，從而反過來促進(jìn)乳腺癌的惡化。

2.4 CircRNA與子宮內(nèi)膜癌

在其他婦科腫瘤研究中，Yang 等[38]發(fā)現(xiàn)Circ-ITCH可以競爭性的連接到miR-17和miR-224，從而影響p21和PTEN的不同表達(dá)，PTEN的突變或缺失可使其酶活性失活，然后PTEN失去抑制細(xì)胞增殖的能力，PTEN位于10 號染色體上，其可以參與磷酸酶和肌張力蛋白的表達(dá)，磷酸酶和肌張力蛋白同源物是一種具有磷酸酶活性的癌癥抑制物，因?yàn)樗梢砸种品至选⒃鲋?、侵襲、遷移及并加速癌細(xì)胞的凋亡。因此，當(dāng)PTEN的突變或缺失可使其酶活性失活，細(xì)胞傾向于惡性腫瘤，可能會引起子宮內(nèi)膜癌。同時Chen 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，正常人子宮內(nèi)膜癌組織中CircRNAs 表達(dá)水平較低，因此CircRNAs 水平的變化對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生具有一定的診斷價(jià)值。

3 CircRNA在婦科腫瘤疾病的診療中面臨的挑戰(zhàn)

綜合上述研究分析可知，CircRNA已經(jīng)越來越備受科學(xué)界所關(guān)注，其參與機(jī)體細(xì)胞分子生物學(xué)調(diào)控的機(jī)理也不斷被揭露，然而這些研究都是處于初步研究階段。CircRNA在生物體內(nèi)廣泛存在，但是各種潛在CircRNA分子信息庫的構(gòu)建目前還待完成，同時這些CircRNA在不同疾病的信號通路調(diào)控路徑還需要進(jìn)一步研究。通過對婦科腫瘤疾病相關(guān)CircRNA分子調(diào)控的近些年研究總結(jié)可知，CircRNA在婦科腫瘤疾病的診斷、病程發(fā)展判斷和靶向分子治療藥物的研究具有重要指導(dǎo)意義。但是，在不同類型婦科腫瘤發(fā)生相關(guān)CircRNA 之間的關(guān)聯(lián)性研究方面較少，仍需要進(jìn)一步深入挖掘。同時，不同CircRNA在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生及抑制過程中角色研究目前還不清楚。特別是在癌癥不同階段，CircRNA分子之間、CircRNA分子與miRNA分子之間復(fù)雜協(xié)作機(jī)理的研究均是未來科學(xué)認(rèn)知的挑戰(zhàn)。

4 展望

婦科惡性腫瘤是婦科疾病中對患者傷害最大的疾病，目前對惡性腫瘤的治療無特效的藥物，主要通過早期診斷及早期治療方式改善預(yù)后。為了有效提升早期診斷準(zhǔn)確性，分子生物學(xué)診斷技術(shù)在婦科腫瘤疾病的診療中越來越收到關(guān)注。CircRNA 是非編碼RNA家族后起之秀，越來越多的研究證實(shí)其在生物體中種類豐富多樣，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在細(xì)胞或組織中特定表達(dá)。因此，基于不同CircRNA分子建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后期婦科腫瘤在疾病預(yù)防及治療藥物的研發(fā)提供了重要的指導(dǎo)思路。除此之外，CircRNA分子在臨床疾病診斷中新型快速檢測技術(shù)的研發(fā)同樣是未來發(fā)展的一種趨勢。