新型冠狀病毒實驗室診斷技術(shù)進(jìn)展

席婧媛 于廣鑫 錢相君 魯鳳民，2★

冠狀病毒曾在人間引起多次流行，其中最為嚴(yán)重的就是21世紀(jì)初暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）感染[1]。新型冠狀病毒（SARSCoV-2）是迄今為止被發(fā)現(xiàn)的第7種可感染人的冠狀病毒。生物信息學(xué)及形態(tài)學(xué)分析表明，SARSCoV-2 屬于β-冠狀病毒，具有冠狀病毒的典型特征，全基因組序列分析顯示，該病毒與蝙蝠攜帶的SARS 樣冠狀病毒RaTG13 株親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到96%；近日有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 已經(jīng)演化出L和S 兩個亞型，二者之間在傳播和致病能力上可能存在較大區(qū)別[2-4]。SARS-CoV-2 在人間傳染性極強(qiáng)，且發(fā)病后存在發(fā)展為重癥、甚至死亡的可能。因此，對感染者早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療十分關(guān)鍵。

1 診斷方案變遷及仍存在的問題

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

隨著對新型冠狀病毒肺炎（Corona virus Disease 2019，COVID-19）認(rèn)識的不斷加深，新型冠狀病毒肺炎診療方案（簡稱診療方案）及其中的診斷標(biāo)準(zhǔn)也在不斷進(jìn)行著更新和完善。在診療方案（第一版）中，疑似病例主要根據(jù)患者的流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)進(jìn)行判斷，并主要依靠對其標(biāo)本的病毒全基因組測序進(jìn)行確診。隨著核酸檢測試劑盒的面世，在隨后的診療方案（第二版）至診療方案（第六版）中，疑似病例的病原學(xué)檢查確診標(biāo)準(zhǔn)更新為：實時熒光RT-PCR檢測病毒核酸陽性或病毒基因測序結(jié)果與已知的新型冠狀病毒高度同源；而最新的診療方案（第七版）則在前版的基礎(chǔ)上增加了對疑似病例血清學(xué)檢查確診的選項：血清新型冠狀病毒特異性IgM 抗體和IgG 抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG 抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高。值得一提的是，在診療方案（第五版）及其修訂版中對于湖北省內(nèi)還特別增加了“臨床診斷病例”，該診斷主要基于疑似病例合并肺炎影像學(xué)特征做出，這一改變在短期內(nèi)使當(dāng)?shù)卮罅看罩蔚幕颊叩玫搅嗽\斷和及時收治；但對“確診病例”的診斷，不論是對湖北省內(nèi)還是省外，仍規(guī)定應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的病原學(xué)檢測方能確診。在診療方案（第六版）和診療方案（第七版）中，對湖北省內(nèi)外的診斷標(biāo)準(zhǔn)已無區(qū)別[5]。

確診標(biāo)準(zhǔn)中另一個主要變化是病毒檢測標(biāo)本的取樣方式和位置。診療方案（第一版）規(guī)定采集痰液、咽拭子等呼吸道標(biāo)本；在第二至第三版中增加了下呼吸道分泌物；第四至第五版中在增加了血液和糞便標(biāo)本后，又特別強(qiáng)調(diào)了呼吸道和血液標(biāo)本的檢測；在最新的第六和第七版中則指出檢測下呼吸道標(biāo)本（痰或氣道抽取物）更加準(zhǔn)確。這些變化提示，隨著對SARS-CoV-2 及其所引起肺炎的臨床和基礎(chǔ)研究不斷加深，診療方案仍有必要根據(jù)形勢及時進(jìn)行更新與修訂。

1.2 疑似病例的排除和出院標(biāo)準(zhǔn)

目前最新的診療方案（第七版）對疑似病例的排除做出了規(guī)定：疑似病例連續(xù)兩次SARS-CoV-2核酸檢測陰性（采樣時間至少間隔24 小時）且發(fā)病7天后SARS-CoV-2 特異性抗體IgM和IgG 仍為陰性可排除疑似病例診斷。在患者出院標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定中，除了要求體溫恢復(fù)正常3天以上、呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn)和肺部影像學(xué)顯示急性滲出性病變明顯改善外，還要求連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標(biāo)本核酸檢測陰性，且規(guī)定采樣間隔時間至少24 小時[5]。然而，最近徐海波等[6]在其研究中發(fā)現(xiàn)有4例已經(jīng)符合出院或解除隔離標(biāo)準(zhǔn)的COVID-19 患者在5 至13天后RT-PCR 復(fù)檢結(jié)果卻為陽性。這進(jìn)一步引起了人們對少部分康復(fù)患者是否仍可能是病毒攜帶者和潛在傳染源的擔(dān)憂。隨著臨床治愈患者的不斷增加，思考并嘗試回答這一問題尤為重要。

2 核酸檢測

新型冠狀病毒作為一種新出現(xiàn)的病原體，很難用病毒分離培養(yǎng)方法在較短時間進(jìn)行臨床檢測。因此，基于病毒基因組測序和實時熒光定量RT-PCR 法等的核酸檢測技術(shù)成為最早用于確診新型冠狀病毒感染的病原學(xué)手段。

2.1 病毒基因組測序

基因組測序以其在新發(fā)病原體檢測方面的優(yōu)勢，在疫情早期病原學(xué)診斷及病毒基因組序列的鑒定上做出了巨大貢獻(xiàn)。疫情爆發(fā)之初，我國科研團(tuán)隊最早在5天內(nèi)就完成了對新型冠狀病毒基因組的鑒定分析，并公開了基因組序列[7-9]，為接下來的臨床篩查、診斷和治療贏得了寶貴的時間。

2.2 基于擴(kuò)增技術(shù)的病毒核酸檢測

隨著新型冠狀病毒基因組序列的公布，國內(nèi)外多個團(tuán)隊迅速據(jù)此設(shè)計出了基于RT-PCR 技術(shù)的檢測方法，這些技術(shù)多采用TaqMan 探針法，其引物探針設(shè)計主要集中在ORF1ab、E 基因和N 基因[10，11]。這為及時發(fā)現(xiàn)感染者并進(jìn)行隔離治療提供了可靠的實驗室手段，為疫情控制提供了依靠。與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，恒溫擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢在于整個反應(yīng)可在一個溫度下完成，規(guī)避了頻繁的升降溫過程，使檢測耗時更短、操作安全性增加，更適合不具備PCR 實驗設(shè)備及條件的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)用于開展病毒檢測和診斷。目前，國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）已經(jīng)應(yīng)急批準(zhǔn)了10個可用于臨床檢測的新型冠狀病毒核酸檢測試劑，有效緩解了實驗室診斷能力不足的問題。

2.3 CRISPR 技術(shù)

除了上述檢測方法之外，張峰團(tuán)隊[12]研制了一種基于CRISPR 技術(shù)檢測新型冠狀病毒RNA的方法，并將其開發(fā)成了一種即時檢驗（point-of-care testing，POCT）產(chǎn)品，其特點在于不依賴復(fù)雜儀器，一小時內(nèi)即可在試紙條上呈現(xiàn)檢測結(jié)果。目前該方法尚處于驗證階段，還不能直接應(yīng)用于臨床。

2.4 局限性

病毒核酸假陰性是基于擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法在臨床應(yīng)用中遇到的最大挑戰(zhàn)。即使是在確診病例中，SARS-CoV-2 核酸檢測陽性率也僅有30%～50%。從病程角度考慮，患者從感染到癥狀出現(xiàn)，潛伏期平均為5.2天[13]，因此在感染極早期階段，患者樣本中病毒載量低于試劑檢測下限是有可能的，此時需要連續(xù)數(shù)次采集標(biāo)本進(jìn)行檢測才能降低假陰性率。此外，近日公布的對新型冠狀病毒感染患者的微創(chuàng)組織活檢和尸體解剖結(jié)果均顯示，SARS-CoV-2 主要感染部位在人體下呼吸道及肺部[14-15]。但采集肺泡灌洗液由于操作復(fù)雜、操作者的暴露風(fēng)險大，臨床應(yīng)用受限。盡管指南強(qiáng)調(diào)留取痰液對提高檢出率的重要性，然而部分病患僅有干咳或無咳嗽癥狀，痰液采集較為困難，因此臨床仍以上呼吸道的鼻咽拭子采集為主，而鼻咽拭子采集隨機(jī)性較高，受采樣技術(shù)影響較大。一項對18例患者的72個鼻咽拭子的檢測結(jié)果分析提示，在上呼吸道樣本中鼻拭子的病毒載量高于咽拭子[16]?？梢姡蓸硬课坏膹?fù)雜性以及采樣不精準(zhǔn)是造成假陰性的重要原因之一。據(jù)Yang等[17]報道，有些患者在出現(xiàn)癥狀后約5～6 d，咽拭子和痰液樣本中的病毒載量達(dá)到峰值，而另有部分患者在住院期間，痰液樣本中病毒載量會發(fā)生波動，結(jié)合部分患者達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)后核酸復(fù)檢陽性這一事實，推測SARS-CoV-2 很可能有間歇性排毒現(xiàn)象，這對于病毒核酸的檢測十分不利，如能在當(dāng)前政策的基礎(chǔ)上，適當(dāng)嚴(yán)格疑似病例的排除和出院標(biāo)準(zhǔn)，例如增加采樣部位或檢測次數(shù)，將有利于控制疫情傳播[6]?？紤]到SARS-CoV-2 是RNA病毒，多數(shù)醫(yī)院由于條件受限，需要將樣本運送到當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防與控制中心或第三方實驗室進(jìn)行檢測，而運輸過程中的降解可能是造成假陰性的另一個原因。另外，就試劑質(zhì)量而言，早期的引物設(shè)計參考序列有限，加上應(yīng)急審批流程，不少試劑并未得到足夠數(shù)量的臨床標(biāo)本進(jìn)行驗證[18]。而且，往往只有在出現(xiàn)癥狀5天內(nèi)從咽拭子中分離出的病毒才具有復(fù)制活性[19]。因此，感染后不同時間、不同部位病毒核酸檢出的實際臨床意義仍有待進(jìn)一步研究。

引物和探針選取靶點的不同會影響擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，進(jìn)而影響弱陽性樣本的檢出。因此有必要通過全國協(xié)作獲得盡可能多時間和地理上無關(guān)的SARS-CoV-2 臨床分離株，通過二代測序分析，進(jìn)一步評估病毒突變的程度，提高對病毒變異規(guī)律的認(rèn)識，以促進(jìn)更為保守序列的確定和兼容引物、探針的設(shè)計，實現(xiàn)檢測試劑的更新?lián)Q代。同時，大力研發(fā)高敏核酸檢測試劑，及早發(fā)現(xiàn)處于低病毒潛伏期的感染者，將有利于疫情控制。

3 抗-SARS-CoV-2 特異性抗體檢測

機(jī)體發(fā)生感染性疾病后也可通過抗體檢測進(jìn)行快速診斷，檢測的靶標(biāo)主要是針對不同病原體產(chǎn)生的特異性抗體。IgM 被認(rèn)為是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，通過檢測病毒特異性IgM可早期診斷病毒感染；IgG 在血清中略晚于IgM 出現(xiàn)，但其對病毒感染仍具有輔助診斷價值，而且，因在血清中維持時間較長，IgG 還可應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查[20]。目前臨床上常用于抗體檢測的方法主要有免疫膠體金技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定。

3.1 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金診斷技術(shù)起源于上世紀(jì)80年代，它是一種以膠體金為標(biāo)記物，在免疫分析中對樣本中蛋白等生物大分子進(jìn)行定性檢測的免疫學(xué)技術(shù)。最近，多家單位共同研發(fā)出了SARS-CoV-2 IgM和IgG 抗體膠體金檢測試劑盒，并以核酸檢測結(jié)果作為參考，對已知樣本進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以核酸檢測陽性人群為陽性對照，健康人群為陰性對照，IgM 或IgG 單獨檢測時的靈敏度分別為79%和73%，特異度分別為98%和99%；而二者聯(lián)合檢測時，靈敏度和特異度分別達(dá)到了88%和98%。進(jìn)一步檢測核酸陰性的疑似患者樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgM和IgG 聯(lián)檢時，該人群中陽性檢出率高達(dá)66%[21]。這說明，抗體檢測對COVID-19 有很好的輔助診斷價值。膠體金法抗體檢測具有操作簡便、耗時短、靈敏度高等優(yōu)點，但其缺點是無法進(jìn)行定量，臨床上往往只用于快檢初篩。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定

與膠體金快速檢測法相比，酶聯(lián)免疫吸附法以其精確定量能力在抗體檢測中有獨特的優(yōu)勢。近日一項小樣本調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19 患者入院時，使用酶免法檢測血清中SARS 相關(guān)冠狀病毒（SARSr-CoV）IgM和IgG 滴度往往較低或呈陰性，而到第5天時，幾乎所有患者都出現(xiàn)了抗體陽轉(zhuǎn)或水平升高。其中IgM 陽性率從50%提高到了81%，IgG 陽性率則從81%提高到了100%，而這些患者并非全部可檢出核酸陽性[22]。這說明，使用酶免法對SARSr-CoV IgM和IgG 進(jìn)行檢測，可有效提高感染患者檢出率，使可能感染新型冠狀病毒的人群能被更早鑒別出來。近日，也有基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法的SARS-CoV-2 IgM 或IgG 檢測試劑通過NMPA 應(yīng)急審批。

3.3 抗-SARS-CoV-2 特異性抗體檢測的潛在應(yīng)用價值

根據(jù)既往有關(guān)SARS-CoV 的文獻(xiàn)報道，患者在出現(xiàn)癥狀后大約一周時血清中即可檢測到針對SARS-CoV 的特異性抗體，其中IgM 在感染后數(shù)周迅速達(dá)到峰值，之后逐漸下降，而IgG 則可在更長時間內(nèi)維持高水平狀態(tài)[23-25]。在最近更新的診療方案（第七版）中，抗-SARS-CoV-2 IgM和IgG 檢測已被納入，該舉措可以彌補(bǔ)單核酸檢測假陰性帶來的漏診，使更多患者盡早被篩檢出來，實現(xiàn)早診治、早隔離，避免感染擴(kuò)散。而且，鑒于SARS-CoV-2為新發(fā)病原體，目前對它了解不足，后續(xù)的血清流行病學(xué)調(diào)查仍需進(jìn)行，抗-SARS-CoV-2 IgG 的檢測對于明確其傳播途徑、流行病學(xué)規(guī)律和感染轉(zhuǎn)歸等具有非常關(guān)鍵的作用。

截至目前，尚未見報道稱有患者在急性感染SARS-CoV-2 后發(fā)生了慢性化，盡管感染SARSCoV-2 所致的危重患者病死率較高，但危重患者在所有感染者中所占比例并不高，還有相當(dāng)比例的確診感染者（病毒核酸檢測陽性）無癥狀或為輕癥病例。由此可以推測，COVID-19 很可能屬于自限性的感染性疾病，對于這類疾病，建立有效的特異性免疫是機(jī)體清除病原體的主要方式，雖然這種免疫反應(yīng)也很可能引起繼發(fā)的病理損傷，進(jìn)而導(dǎo)致患者病情加重。中和抗體是指能消除病毒感染性或細(xì)菌毒素生物學(xué)效應(yīng)的抗體，對于SARS-CoV-2來說，中和抗體很可能通過封閉S 刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)域來阻斷病毒感染。Alexandra 等[26]的最新研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV S 小鼠多克隆血清可有效抑制SARS-CoV-2 病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，結(jié)合COVID-19康復(fù)者血清對患者具有顯著療效的臨床事實，初步推測機(jī)體在暴露于SARS-CoV-2 后的確有可能自發(fā)產(chǎn)生中和抗體。如果能通過進(jìn)一步的臨床和流行病學(xué)研究確證SARS-CoV-2 感染的自限性，那么SARS-CoV-2 中和抗體的產(chǎn)生是否能夠提示病毒已發(fā)生清除，這是一個亟需探討的問題。綜上所述，目前將抗-SARS-CoV-2 抗體檢測納入疑似病例排除和確診標(biāo)準(zhǔn)中是及時且必要的，未來抗-SARS-CoV-2 IgG 能否作為判定治愈的實驗室檢測指標(biāo)亦值得考慮。

4 展望

近期NMPA在批準(zhǔn)了基于測序和RT-PCR 技術(shù)的核酸檢測試劑用于臨床診斷后，又批準(zhǔn)了2個基于膠體金法和2個基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的SARS-CoV-2 抗體檢測試劑盒?？贵w檢測試劑的推出方便了社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心及基層醫(yī)院的早篩早診，增加了檢測和診療的時效性，進(jìn)一步滿足了疫情高發(fā)區(qū)對新型冠狀病毒感染的實驗室診斷需求。考慮到SARS-CoV-2 此前從未在人間流行的事實，診療方案（第七版）中加入血清學(xué)抗體診斷的內(nèi)容非常及時，但前提是要保證抗體試劑與其它病原體特別是在人間季節(jié)性流行的引起普通感冒的病原體抗體無交叉反應(yīng)?？贵w檢測的納入將有助于減少漏診，避免疫情進(jìn)一步擴(kuò)散，而對這類人群的早診斷早隔離將對當(dāng)?shù)匾咔榭刂破鸬綐O大的積極作用。此外在疫情高發(fā)區(qū)，針對抗-SARSCoV-2 IgG 的檢測是否需要堅持遵守間隔一定時間抗體滴度4倍升高的限制仍值得商榷；最后，在持續(xù)開展疫情防控工作的同時，建議及早開展新型冠狀病毒感染流行病學(xué)調(diào)查，這將有利于更好地認(rèn)識疫情的發(fā)生、發(fā)展過程，對今后的防疫工作將具有極大的現(xiàn)實意義。