生長(zhǎng)分化因子15對(duì)新生血管作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張凌宇 路強(qiáng)

GDF-15(growth differentiation factor-15，GDF-15)是GDF-15基因編碼產(chǎn)生的一種具備多種生物學(xué)效應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白。GDF-15參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥及腫瘤發(fā)生等病理過(guò)程。在缺氧、缺血和腫瘤等病理?xiàng)l件下GDF-15表達(dá)顯著上調(diào)，激活ERK1/2、AKT和SMAD2/3等相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移及新的血管的生成?，F(xiàn)階段有大量研究指出GDF-15可以影響新生血管的形成，而且與新生血管性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

一、GDF-15的結(jié)構(gòu)及其作用

GDF-15是TGF-β超家族成員，由Bottner等首次從U937 cDNA文庫(kù)中分離得到[1]。GDF-15基因由位于19號(hào)染色體上的兩個(gè)外顯子及一個(gè)內(nèi)含子組成，GDF-15由308個(gè)氨基酸多肽組成，包括29個(gè)氨基酸信號(hào)肽、112個(gè)氨基酸成熟蛋白和167個(gè)氨基酸前肽。GDF-15在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)為35-kDa前體蛋白，該蛋白裂解加工后以17-kDa分泌蛋白的形式排入內(nèi)環(huán)境[2]。

生理狀態(tài)下,GDF-15在胎盤(pán)與前列腺組織中表達(dá)偏高，其余組織中表達(dá)弱而穩(wěn)定。在缺氧、炎癥等病理情況下, 表達(dá)增加的GDF-15能夠通過(guò)旁分泌或/和自分泌等途徑作用于細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及抗炎等生理過(guò)程。GDF-15與GDNF家族受體α(GFRa)樣蛋白結(jié)合可以激活下游能量代謝信號(hào)通路，起到提高代謝水平、降低體重的作用[3]。GDF-15還可以通過(guò)改善胰島素抵抗、增加糖耐量等機(jī)制延緩糖尿病的進(jìn)展[4]。有研究顯示，GDF-15可以通過(guò)激活A(yù)kt和抑制內(nèi)源性活性ERK信號(hào)通路來(lái)防止低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡[5]。此外，GDF-15可以調(diào)節(jié)小鼠前額葉內(nèi)側(cè)皮層神經(jīng)元K+和Ca2+離子通道的表達(dá)，增加了興奮性遞質(zhì)的釋放[6]。近年來(lái)，GDF-15的促新生血管生成的作用也逐步被發(fā)現(xiàn)，有研究指出GDF-15的促進(jìn)新生血管生成作用還可以通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌來(lái)完成。

二、GDF-15影響新生血管生成的作用機(jī)制

1.GDF-15調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是新生血管生成的重要一環(huán)，而細(xì)胞周期調(diào)控著細(xì)胞增殖,其中G1到S和G2到M是最重要并且易受外界干擾的兩個(gè)階段。有研究證明GDF-15可以通過(guò)PI3K-AKT、ERK、JNK信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)，加快人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移。當(dāng)阻斷GDF-15表達(dá)后，GDF-15對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的積極作用被消除[7]。Guillaume等[8]發(fā)現(xiàn)GDF-15激活ERK1/2、AKT和SMAD2信號(hào)通路后，可以明顯增加G0-G1和G2-M期的人血內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)了人血內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，由此證明了GDF-15對(duì)細(xì)胞G2-M周期也有調(diào)節(jié)作用。

2.GDF-15可以改善血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, ，EPCs) 是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，通過(guò)其血管再成能力及極高的分化潛能參與內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)。體外研究發(fā)現(xiàn)，衰老的內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌GDF-15，通過(guò)激活A(yù)KT、ERK1/2和SMAD2信號(hào)通路，促進(jìn)正常內(nèi)皮祖細(xì)胞維持功能正常，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。其中GDF-15對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力，達(dá)到了與VEGF相似的遷移水平，這可能與GDF15激活A(yù)KT通路，調(diào)節(jié)eNOS激活，上調(diào)NO有關(guān)[8]。

3.GDF-15抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 GDF-15在不同條件下可以通過(guò)調(diào)控ROS、Bcl-2、p53等信號(hào)通路相關(guān)因子抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。高糖誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡被證明與ROS濃度增加導(dǎo)致的繼發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。在高葡萄糖條件下GDF15表達(dá)明顯上調(diào)，GDF15通過(guò)維持PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路的的活性狀態(tài)并且抑制NF-kB/JNK信號(hào)通路的激活，下調(diào)ROS含量從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡具有保護(hù)作用[9]。p53作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)激誘導(dǎo)下導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、凋亡和衰老。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡因子，保護(hù)細(xì)胞在外界刺激性免受凋亡。在應(yīng)激信號(hào)的反應(yīng)下，胞質(zhì)p53轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)，并且與抗凋亡和促凋亡的Bcl-2家族成員的多結(jié)構(gòu)域成員相互作用，直接參與線粒體外膜通透性的內(nèi)源性凋亡途徑。缺氧條件下，GDF-15在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)p53的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，隨著GDF-15的減少，缺氧24 h的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和衰老顯著增加[10]。有研究顯示，GDF-15可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)Bcl-2存活蛋白和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶的表達(dá)上調(diào)，從而阻止心肌細(xì)胞凋亡。在小鼠心肌梗死模型中，GDF-15缺陷小鼠較正常對(duì)照組心臟缺血再灌注損傷后梗死邊緣區(qū)梗死面積明顯增大，心肌細(xì)胞凋亡增加[11]。

4.GDF-15調(diào)控VEGF的表達(dá) GDF-15可以通過(guò)P53或非P53等信號(hào)通路上調(diào)VEGF從而促進(jìn)血管生成。目前最重要的血管生成刺激因子是VEGF，其表達(dá)直接影響新生血管的生成，任何影響VEGF表達(dá)的因子都可以影響新生血管生成。缺氧條件下，內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的上調(diào)是通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的激活來(lái)調(diào)控的，GDF-15可以通過(guò)抑制P53,激活HIF-1α信號(hào)通路來(lái)調(diào)控VEGF的表達(dá),從而促進(jìn)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[12，13]。P53/HIF-1α通路的表達(dá)在GDF-15缺氧環(huán)境下促進(jìn)血管生成也具有關(guān)鍵作用，HIF-1α基因的敲除以及添加NutLI-3阻斷了p53-MDM2相互作用后， GDF-15對(duì)VEGF及人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響將會(huì)被消除[10]。但是在乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中，GDF-15可以不依賴P53通路，通過(guò)反活化ErbB2來(lái)使 PI3K/Akt/mTOR和 ERK-1/2顯著磷酸化，進(jìn)而使 HIF-1α和VEGF的表達(dá)上調(diào)[14]。

GDF-15自身也具有促血管生成作用，但目前機(jī)制尚未明確。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，通過(guò)添加GDF-15(10 ～ 100 μg/l)，24 h的細(xì)胞增殖率超過(guò) VEGF(20 mg/l)，且GDF-15在24 h 時(shí)DNA合成期與DNA合成后期細(xì)胞比例均高于 VEGF 組，由此證明了除VEGF 途徑外，GDF-15還可以通過(guò)別的通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。這可能與GDF-15可以改善血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能,加快內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有關(guān)。黑色素瘤細(xì)胞分泌的GDF-15可以與VEGF共同調(diào)節(jié)新生血管的生成[16]。Shao等[17]證明了上述結(jié)論，并進(jìn)一步在體外基質(zhì)凝膠血管生成模型中進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)，研究證明GDF-15可以促進(jìn)了體外基質(zhì)凝膠毛細(xì)血管分支點(diǎn)的形成。

三、GDF-15與新生血管生成相關(guān)疾病

1.GDF15與動(dòng)脈粥樣硬化癥 動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中、心肌梗死及血栓性疾病等心腦血管疾病的的基礎(chǔ)病變,也是一種常見(jiàn)的緩進(jìn)型疾病。缺氧可以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中新生血管的生成，這種不成熟的血管不僅為不穩(wěn)定斑塊的形成提供了有利條件，也是是斑塊破裂及斑塊內(nèi)出血的重要原因之一[18]。GDF-15對(duì)于血管生成具有調(diào)節(jié)作用，高水平的GDF-15是人動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者側(cè)支循環(huán)的形成與血清GDF-15水平呈正相關(guān)，由此推斷血清GDF-15可以通過(guò)保護(hù)心肌組織并促進(jìn)新生血管的生成，從而加快冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)的形成[19]。Aisha Gohar[18]發(fā)現(xiàn)高循環(huán)GDF-15水平僅與女性頸動(dòng)脈粥樣硬化性疾病行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)后繼發(fā)心血管事件發(fā)生的概率呈正相關(guān)。GDF-15對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化不僅只有保護(hù)作用，有學(xué)者在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的GDF-15可以縮小動(dòng)脈粥樣硬化病灶的大小,但是早期動(dòng)脈粥樣硬化GDF-15的缺乏可以增加斑塊的穩(wěn)定性。GDF-15對(duì)心肌組織的保護(hù)及抗凋亡作用可能與ERK1/2、SMAD2/3、ROS誘導(dǎo)的NF-kB/JNK及PI3K/AKT/eNOS等信號(hào)通路有關(guān)，其更具體的分子信號(hào)機(jī)制還有待研究。

局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙是腦卒中的基本病理改變，動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的血管壁病變是腦卒中的主要病因之一。急性缺血性卒中患者高GDF-15濃度與不良預(yù)后密切相關(guān)[20]，也有研究[21]指出腦卒中患者的患者血清GDF-15濃度明顯高于對(duì)照組，血清GDF-15含量與腦梗死面積與成正相關(guān)，并且因腦卒中死亡患者較存活患者的血清GDF-15含量明顯升高。由此提示高濃度GDF-15與急性缺血性腦卒中的不良臨床結(jié)局獨(dú)立相關(guān)，并且血清GDF-15可為確定預(yù)后不良的高危缺血性腦卒中患者提供額外信息。

2.GDF-15與腫瘤 新血管生成現(xiàn)象普遍存在于維持腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，新生血管為腫瘤轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持，腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移伴隨著新生血管的生成。有研究表明，GDF-15促進(jìn)骨肉瘤[22]、結(jié)腸癌[23]、膀胱癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。在黑色素瘤中，MAPK信號(hào)通路的BRAF-V600E突變體可促進(jìn)GDF-15分泌，通過(guò)比較GDF-15和VEGF在雞絨毛尿囊膜和基質(zhì)凝膠塞中新生血管生成的作用，證實(shí)了GDF15促進(jìn)黑色素瘤血管生成的作用[16]。經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)是不可切除肝癌的主要治療方法，但是該術(shù)式引起的缺氧性血管生成與治療失敗有關(guān)。Gang Dong[24]研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞受到化療損傷后GDF15表達(dá)明顯增加，并且化療損傷后肝癌細(xì)胞分泌的GDF15可以通過(guò)激活Src及其下游的AKT，MAPK和NF-KB信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖、遷移和成管作用。由此證明了腫瘤細(xì)胞化療損傷后分泌的GDF15可能促進(jìn)腫瘤血管生成，最終導(dǎo)致殘留腫瘤細(xì)胞發(fā)展。

3.GDF-15與糖尿病腎病 糖尿病腎病病理改變的早期有腎小球?yàn)V過(guò)功能亢進(jìn)、腎小球和腎小管上皮細(xì)胞肥大等病理變化，隨著病情進(jìn)展蛋白尿產(chǎn)生，最終發(fā)展為腎小球硬化和終末期腎病。早期研究在糖尿病腎病患者腎小球微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)有不成熟的毛細(xì)血管生成[25]，隨后證明其中存在內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并伴有異常新生血管生成[26]。這些發(fā)生在糖尿病腎病的早期，腎功能輕度損傷時(shí)。VEGF[27]、富含亮氨酸的α2-糖蛋白[28]等多種促血管生成因與糖尿病腎病新生血管生成相關(guān)。有研究顯示，中和性抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A抗體、內(nèi)源性血管生成抑制劑血管抑制素-1、內(nèi)皮抑素[29]等多種新生血管形成抑制因子可以改善糖尿病腎病的早期病理改變，延緩病程進(jìn)展[30]。既往大量研究證明GDF-15與糖尿病腎病有關(guān)，在糖尿病腎病患者血漿中，GDF-15表達(dá)上調(diào)，并且與反應(yīng)腎功能損傷程度的血肌酐、尿白蛋白水平呈正相關(guān)。在早期腎功能輕度受損時(shí)，GDF-15較尿白蛋白更加敏感[31，32]，這與糖尿病腎病新生血管生成時(shí)，生長(zhǎng)因子上調(diào)而腎小球血管未漏出蛋白尿一致[33]，故我們推測(cè)GDF-15可能參與糖尿病腎病的異常新生血管生成。

4.GDF-15與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR) DR與糖尿病腎病同屬糖尿病微血管病變,血管新生是非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)進(jìn)展到增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的關(guān)鍵過(guò)程。在DR中新生血管的生成是由于高血糖條件下視網(wǎng)膜血管缺血、缺氧,視網(wǎng)膜為了代償局部供氧致使血管亂序再生的過(guò)程。DR的發(fā)病機(jī)制較多,其中蛋白激酶 C 激活、氧化應(yīng)激以及生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)等已經(jīng)達(dá)成了廣泛共識(shí),但確切機(jī)制未完全清楚[34]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生的重要細(xì)胞,VEGF作為DR最重要的細(xì)胞因子, Ponnalui等發(fā)現(xiàn)缺氧條件下,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中GDF-15基因表達(dá)升高[35]，而缺氧條件下GDF-15可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，倆者在視網(wǎng)膜疾病中關(guān)系值得進(jìn)一步研究。既往研究發(fā)現(xiàn)GDF-15在DR患者的血漿及增生型DR患者的玻璃體中表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步證明了GDF-15可能參與DR的進(jìn)展[36]。

四、總結(jié)

GDF-l5是一種具有廣泛生物學(xué)功能的應(yīng)激蛋白，與新生血管相關(guān)性疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系。GDF-15是心肌梗死、腦卒中、缺血-再灌注損傷及糖尿病腎病的潛在的發(fā)病與疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子。雖然GDF-15多種新生血管性疾病的關(guān)系已經(jīng)被證實(shí)，但是關(guān)于GDF-15與眼科新生血管疾病的研究尚位于初級(jí)階段，如GDF-15參與DR的具體機(jī)制尚未有明確的定論，還有許多問(wèn)題有待研究。隨著研究逐步深入，GDFl5或許可以為DR等眼科新生血管性疾病提供新的診療思路和治療途徑。