角膜基質(zhì)透鏡修復(fù)角膜缺損的實驗研究

李霞 林芳 雷代坤 高曉唯 劉毅 李鵬 蔡巖

隨著飛秒激光近視手術(shù)的發(fā)展，飛秒激光微小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(small incision lenticule extraction,SMILE)中，透明角膜基質(zhì)取材廣泛，如能對其加以利用，將對臨床有重要的指導(dǎo)意義。角膜損傷伴有角膜組織缺損，如直接縫合，常發(fā)生角膜變形，房水滲漏，形成淺前房、眼內(nèi)感染等并發(fā)癥。為了避免這些并發(fā)癥的發(fā)生，臨床上通常強行縫合角膜穿孔傷，但術(shù)后較嚴重的高度散光和不規(guī)則瘢痕愈合，極度影響II期、III期的術(shù)后效果。 本研究制作兔透明角膜基質(zhì)透鏡修復(fù)角膜缺損動物模型，觀察其在角膜組織損傷修復(fù)中的機制及作用。

資料與方法

一、實驗材料

1.健康清潔級新西蘭白兔30只，雌雄兼用，質(zhì)量2.00～2.50 kg，年齡2～3個月，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2.透明角膜基質(zhì)的取材：人角膜基質(zhì)透鏡組織

圖1 角膜缺損模型設(shè)計及制作方法 先行前房穿刺(黑色箭頭)，用消毒濾紙片貼服于角膜中央(圖A)，剖切角膜缺損模型(圖 B) 圖2 2 mm× 3 mm ×3 mm術(shù)后 圖A、B 術(shù)后1 d，角膜植片混濁，皺褶，部分虹膜前粘連，前房殘留少量氣泡，前房形成欠佳，故再次行前房注氣，形成前房；術(shù)后3個月，上方周邊仍有少量虹膜前粘連，雖然前房形成，但新生血管侵入角膜(黑色箭頭)，角膜白斑愈合(圖C、D) 圖3 2 mm×2 mm×2 mm 術(shù)后 圖A 術(shù)后1 d，角膜植片混濁，角膜縫線固定，前房形成，前房內(nèi)殘留氣泡，虹膜紋理清晰，瞳孔藥物性散大，前房未見有炎癥反應(yīng)。術(shù)后1個月，角膜瘢翳形成，角膜縫線固定(圖B)，隨著時間推移，2個月時部分縫線松弛(圖C)，術(shù)后3個月時角膜瘢痕愈合，已拆除松弛的角膜縫線(圖D) 圖4 2 mm× 2 mm ×2 mm術(shù)后3個月 圖A、B 其他模型術(shù)后3個月，角膜單層圈套縫合，角膜瘢翳、云翳愈合，縫線上有分泌物粘附，角膜曲率基本正常來源于在我院近視眼治療中心行 SMILE 的近視健康患者( 2019年6月)。

表1 透明角膜基質(zhì)修復(fù)角膜缺損的長期效果

圖5 眼前節(jié)OCT、Pentacam、角膜地形圖檢查(術(shù)后3個月) 前節(jié)OCT顯示：A組角膜缺損處，角膜基質(zhì)填塞，角膜凹凸不平，角膜內(nèi)皮面有虹膜粘附(圖A)，B組角膜缺損處，角膜基質(zhì)填塞，角膜曲率平緩，但層間有間隙(圖B)， Pentacam檢查顯示缺損處角膜高度突出，整體角膜曲率基本正常(圖C)，角膜地形圖顯示，角膜散光仍較大(圖D)

3.透明角膜基質(zhì)保存(30只眼)：藥用無水甘油保存[1]。使用時，取出透明角膜基質(zhì)置于4 ℃的平衡鹽中，去除黏附的甘油，備用。

二、實驗方法

透明角膜基質(zhì)修復(fù)角膜缺損模型制作：新西蘭白兔30只(30只眼)，肌肉注射速眠新(1 ml/kg)，配合水合氯醛溶液(3 ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射全身麻醉，并用鹽酸丙美卡因滴眼液(5 ml/l)滴眼3次表面麻醉，術(shù)前聚氨碘氟酮消毒，手術(shù)均在顯微鏡下實施，用含慶大霉素的生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，上直肌固定縫線，A組用2 mm×3 mm×3 mm、B組用2 mm×2 mm×2 mm大小的消毒濾紙片貼服于右眼角膜中央(見圖1)，選在透明角膜緣做前房穿刺，用尖刀剖切制作全層角膜缺損模型，取復(fù)水的透明角膜基質(zhì)填塞于角膜缺損處，A組用單層、B組用雙層圈套縫合聯(lián)合斜形交叉、加固縫合，術(shù)畢散瞳，涂氧氟沙星眼膏。

三、術(shù)后處理

常規(guī)給予左氧氟沙星滴眼液點3/d、復(fù)方托比卡胺滴眼液點眼3/d、氧氟沙星眼膏點眼1/晚。造模后每日所有動物行裂隙燈觀察眼前節(jié)變化，于造模后1 d、1周、1個月、3個月后各時間點行眼前節(jié)照相。3個月行Pentacam、角膜地形圖檢查后全部處死，光鏡檢查。

結(jié) 果

一、角膜缺損修復(fù)情況(見圖2～5)

二、長期效果：見表(1)，術(shù)后3個月，A組：角膜瘢翳1只眼(6.7%)、角膜白斑14只眼(93.3%)、虹膜部分前粘連10只眼(66.7%)，新生血管侵入角膜11只眼(73.3%)，B組：角膜瘢翳6 只眼40.0%)、角膜白斑9只眼(60.0%)、新生血管侵入角膜1只眼(60.0%)，無虹膜前粘連。

所有透明角膜基質(zhì)修復(fù)角膜缺損的動物均無排斥反應(yīng)發(fā)生。B組術(shù)后隨訪3個月均保持正常的眼球外觀，無淺前房、前房出血、排斥反應(yīng)、角膜裂傷陊開、嚴重角膜扭曲變形發(fā)生。

三、組織病理學(xué)檢查(見圖6)

討 論

對于角膜缺損修復(fù)，縫合技巧雖然至關(guān)重要，但修復(fù)材料決定了修復(fù)的效果。角膜組織缺損的臨床最佳治療方式可行穿透性角膜移植術(shù)，但新鮮角膜來源有限且手術(shù)難度較大，開展較為困難。筋膜、羊膜、鞏膜組織、自體角膜、異體角膜等角膜替代物各有其優(yōu)缺點[2-6]，因此在臨床工作中，開發(fā)和利用角膜替代物具有重要意義。

圖6 角膜組織切片HE染色 角膜基質(zhì)層可見大量的中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤，角膜上皮局部粘附略松弛，基質(zhì)層可見新生血管管腔(x 100，A組，圖A，黑色箭頭)，有大量漿細胞及少量成纖維細胞(x 100, B組，圖B)

近年來，有報道利用SMILE手術(shù)摘除的角膜基質(zhì)透鏡治療角膜穿孔，基質(zhì)透鏡作為角膜基質(zhì)的替代組織用于自體移植或異體供體移植已被報道[7-10]。有角膜基質(zhì)透鏡治療遠視、老花眼，聯(lián)合用角膜交聯(lián)治療角膜基質(zhì)擴張、圓錐角膜等的研究[11-15]。亦有基質(zhì)小透鏡作為補片移植物在治療其他眼病中的應(yīng)用[16，17]。角膜基質(zhì)透鏡有以下幾個方面的優(yōu)點，首先，角膜基質(zhì)透鏡具有良好的生物相容性和強度，薄而透明，其次該透鏡很容易通過SMILE手術(shù)提取，并且成本低廉；但是基質(zhì)透鏡仍有幾個缺點，在不做SMILE手術(shù)的醫(yī)院很難獲得，此外，單個角膜基質(zhì)透鏡的強度及力度仍較弱，直接縫合時容易撕裂，臨床應(yīng)用有其局限性且需進一步研究觀察。目前除了上述臨床報道外，在動物實驗中尚未被探索。

SMILE來源的人角膜基質(zhì)透鏡移植可以有效的治療感染或外傷導(dǎo)致的角膜穿孔。但是，角膜基質(zhì)透鏡究竟可以治療多大的角膜缺損呢？因此我們制作兔透明角膜基質(zhì)透鏡修復(fù)角膜缺損動物模型，嘗試探索其在角膜組織損傷修復(fù)中的適應(yīng)癥、機制及其作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)對于3 mm及以上的全層缺損，縫合困難，A組因虹膜部分前粘連模型較多，前房形成率欠佳，角膜漏導(dǎo)致虹膜前粘連(高達66.7%))，故角膜新生血管發(fā)生率較高(73.3%)，且角膜基質(zhì)透鏡厚度有限，雖然多層疊加、單層折疊后，或許可以達到有效的厚度，但手術(shù)操作難度大，縫合時透鏡片滑動或撕裂，導(dǎo)致植片變形及邊緣成角，造成角膜漏、散光或虹膜前粘連(圖5A)、植片混濁、角膜新生血管侵入(圖2D)。但對于2 mm的角膜全層缺損B組，術(shù)后觀察期間內(nèi)，術(shù)眼未出現(xiàn)感染，出血等并發(fā)癥；未見植片脫落、植片融解、角膜鈣化和免疫排斥等現(xiàn)象，出現(xiàn)1例(6.7%)植片和植床新生血管，所有模型以角膜瘢翳(40.0%) 、角膜白斑(60.0%)愈合(見圖3D、圖4A、圖4B)。但前節(jié)OCT顯示仍有層間間隙形成(圖5B)，所以，對于單純折疊來縫合臨床上仍存在一些問題，應(yīng)行角膜層間粘合后再進行角膜裂傷縫合較為穩(wěn)妥[9，10]；B組3個月時雖然縫合處仍有凸起，但角膜曲率基本平滑(圖5C)，角膜地形圖顯示縫合區(qū)域仍有散光(如圖5D)，因此，單純疊加的角膜基質(zhì)透鏡的生物力學(xué)強度還有待進一步加強。

我們實驗局限性是，沒有設(shè)計板層缺損，并且它不包括使用與羊膜聯(lián)合應(yīng)用情況，我們臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，角膜基質(zhì)透鏡與羊膜一起使用時，成功率及術(shù)后視力恢復(fù)較單純角膜基質(zhì)透鏡好。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，對于大于2 mm×3 mm×3 mm的缺損，行縫合較為困難，最好行全穿透性角膜移植術(shù)或至少聯(lián)合羊膜、筋膜移植；對于2 mm×2 mm×2 mm的角膜缺損，填塞的角膜基質(zhì)透鏡逐漸透明，與角膜組織融合緊密，角膜曲率相對平整，能夠成功保住眼球，患者的視力尚能部分恢復(fù)，可應(yīng)用于角膜組織缺損的替代物，并為二期手術(shù)治療奠定基礎(chǔ)。