原代人眼Tenon’s囊成纖維細胞的生物學特性及體外培養(yǎng)方案優(yōu)化

王麗君 李宏松 張文怡 廖丁瑩 楊熹婷 王建明

青光眼是常見的不可逆致盲性眼病，濾過手術是抗青光眼的主流治療方法，但術2年的失敗率高達15%～30%[1]，研究顯示Tenon’s囊成纖維細胞(human Tenon fibroblasts，HTFs)的增殖、遷移以及纖維化在濾過泡瘢痕化過程中發(fā)揮著重要作用[2，3]。研究HTFs的功能和生長特性有助于了解濾過泡瘢痕形成的機制，也可以為抗濾過泡瘢痕化藥物的研究提供平臺。成纖維細胞的分離及原代培養(yǎng)方法多種多樣，應用較多的有組織塊法和酶消化法[4，5]。組織塊法是將組織剪碎后直接鋪于培養(yǎng)皿底部，加培養(yǎng)基，經(jīng)過數(shù)日培養(yǎng)后細胞從組織塊周圍貼壁爬出生長。酶消化法是將組織塊經(jīng)多種蛋白酶消化后種植于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)分離成出纖維細胞。由于酶消化法步驟繁瑣、所需試劑種類多、操作技術要求高、易污染等原因，現(xiàn)多采用組織塊法培養(yǎng)原代HTFs。但傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)方法存在組織塊貼壁率低、細胞不易爬出、培養(yǎng)效率低的問題，為了解決此類問題，本研究對人Tenon’s囊成纖維細胞的組織塊培養(yǎng)方法進行了優(yōu)化，意在探討一種簡單、經(jīng)濟、有效的原代人Tenon’s囊成纖維細胞培養(yǎng)方法并對體外培養(yǎng)的HTFs的生物學特性進行研究。

資料與方法

一、材料

主要實驗材料有胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司)、DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)、青鏈霉素混合液(索萊寶公司)、PBS(Heart公司)、小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(Santa Cruze公司)、小鼠抗人角蛋白(Cytokeratin)單克隆抗體(Abcam公司)、山羊抗小鼠DyLight649二抗(Abbkine公司)、山羊抗兔DyLight649二抗(Abbkine公司)、DAPI(碧云天公司)、山羊血清工作液(中杉金橋公司)、噻唑藍3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyltetrazolium Bromide(sigma公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma公司)、Tween20(索萊寶公司)、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天公司)。

二、實驗儀器

主要實驗儀器設備有CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、超凈工作臺(蘇凈安泰公司)、倒置顯微鏡(Motic公司)、離心機(長沙湘儀公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(BMG LABTECH公司)、熒光顯微鏡(Leica 公司)、流式細胞儀(ACEA Biosciences公司)。

三、方法

1.取材：采集西安交通大學第二附屬醫(yī)院眼科斜視手術患者的Tenon’s囊組織，患者無全身及其他眼部疾病史，無眼部手術史且年齡小于18歲。取材過程中注意避免沾染結膜上皮組織，置于加有青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1mg/ml的無菌DMEM液中，冰盒儲存，快速轉運至實驗室進行操作。本研究通過西安交通大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批(審批號：(2019)倫審-研第(014)號)。

2.組織細胞的優(yōu)化培養(yǎng)：無菌DMEM液沖洗組織塊3次，高壓滅菌的眼科剪剪除血凝塊，將Tenon’s囊組織剪成1～2 mm3組織塊，20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊，傾斜培養(yǎng)皿小心吸棄培養(yǎng)液，使組織塊自然、均勻的平鋪于6.0 cm培養(yǎng)皿，組織塊表面滴加FBS利于組織貼壁，傾斜培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間注意觀察組織塊，避免組織塊干燥，3 h后加1 ml含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋組織塊繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后補加培養(yǎng)基2 ml，待細胞爬出后每2～3 d輕柔半換液法更換培養(yǎng)液至傳代，期間避免用力晃動培養(yǎng)皿以防止組織塊脫落。

3.細胞傳代：當細胞融合到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，待細胞變圓，細胞間隙變大時加入足量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。移入離心管，800 r/min離心5min；吸棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，按照1：3進行傳代。

4.細胞凍存：收集處對數(shù)生長期的3～4代細胞，凍存前24 h換液1次，0.25%胰蛋白酶消化后離心收集細胞，以含10%DMSO的FBS為凍存液，調(diào)整細胞濃度為4～5×106個/ml，裝入凍存管中。依次在4 ℃放置10 min，-20 ℃放置30 min，-80 ℃過夜，最后放置于液氮中長期凍存。

5.細胞復蘇：液氮中取出凍存管，快速置于37 ℃水浴中，不斷搖晃至凍存液完全溶解，將凍存液轉入含有10倍體積完全培養(yǎng)基的離心管中，混勻后800 r/min離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基垂懸細胞后接種于培養(yǎng)瓶中，放置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后待細胞貼壁后換液1次，以后常規(guī)培養(yǎng)。

6.HTFs的形態(tài)學觀察及免疫熒光細胞染色鑒定細胞：在倒置熒光顯微鏡下觀察HTFs的生長狀態(tài)、數(shù)量、形態(tài)變化等；24孔板的孔內(nèi)放置無菌玻片1片/孔，以2×104個細胞/孔的密度將細胞接種于玻片上。待細胞密度為80%時吸棄原培養(yǎng)液，用4 ℃預冷的PBS輕柔潤洗3次，每次3 min。4%多聚甲醛室溫固定15～20 min，吸棄固定液，用4 ℃預冷的PBS輕柔潤洗3次，每次5 min。0.5%Triton～X100室溫放置15 min，通透細胞膜，PBS輕柔潤洗3次，每次5 min。山羊血清工作液封閉，室溫孵育30 min。吸棄封閉液，加入山羊血清工作液稀釋的一抗(Vimentin 1:50，Cytokeratin 1:250)，陰性對照用PBS代替抗體，4 ℃過夜。第2天吸棄一抗，PBST輕柔潤洗3次，每次5 min。加入DyLight標記的二抗(1:50)，室溫放置1 h，注意避光。吸棄二抗，PBST輕柔潤洗3次，每次5 min。加入DAPI室溫避光放置5 min進行核染。PBST輕柔潤洗3次，每次5 min。使用抗熒光猝滅封片劑封片，并于1 h內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察并拍照計算免疫熒光染色陽性細胞的比例。

7.MTT 法檢測細胞增殖及生長曲線：取第3代HTFs，以3000個/孔接種至96孔板中，每組6個平行孔，同時設置調(diào)零孔，每隔24 h，取6個孔，加入MTT溶液20 μml(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸盡培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，酶標儀讀取490 nm處的吸光度(OD值)。以時間(d)為X軸，以OD值為Y 軸繪制生長曲線。

8.流式細胞術檢測細胞周期：取處于生長對數(shù)期的第3～4代HTFs，胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，離心收集細胞。用預冷的PBS洗滌后，加入1 ml預冷的70%乙醇中固定，4 ℃固定24 h。離心收集細胞，加入約1 ml預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。加入染色緩沖液0.5 ml，PI 25 μl、RNase A 10 ml，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，隨后可以4 ℃避光存放。當日用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光。計算增殖指數(shù)(proliferation index，PI)。增殖指數(shù)PI=(G2/M+S)/(G2/M+G0/G1+S)×100%。[6]

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、原代培養(yǎng)細胞形態(tài)

組織塊貼壁于培養(yǎng)皿底面，第4～7天可以見長梭形細胞從組織塊周圍爬出，貼壁生長，細胞多為長梭形(圖1A)，然后細胞數(shù)量逐漸增多，2～3周左右大量細胞貼壁生長，呈緊密排列的單層長梭形或多邊形，放射狀或漩渦狀排列(圖1B)。傳代后細胞呈長梭形、多角形(圖1C)，細胞匯合程度高時細胞可呈多邊形改變，呈蝸旋狀或者放射狀聚集(圖1D)，均為典型的成纖維細胞形態(tài)表現(xiàn)。細胞1:3傳代后4～5 d長滿，凍存復蘇后細胞生長良好。

二、HTFs生長曲線

細胞傳代后0～2 d細胞數(shù)無明顯增長，處于生長潛伏期；2 d后細胞數(shù)明顯增加，生長曲線斜率增大，呈對數(shù)生長；6 d細胞數(shù)達到最大值；隨后細胞數(shù)有所減少，進入退化期，細胞生長曲線近似S形(圖2)。此生長規(guī)律符合一般細胞的生長規(guī)律，生長曲線結果提示在第3～5 d細胞增殖能力顯著。

圖1 Tenon’s囊成纖維細胞形態(tài)

圖2 Tenon’s囊成纖維細胞生長曲線

圖3 Tenon’s囊成纖維細胞Vimentin及Cytokeratin免疫熒光染色

圖4 Tenon’s囊成纖維細胞細胞周期

三、HTFs鑒定

Vimentin免疫熒光染色陽性細胞的胞漿內(nèi)可見與細胞長軸方向一致的紅色束狀或網(wǎng)狀結構，細胞核未染色，Vimentin免疫熒光染色陽性細胞比例達98%，Cytokeratin免疫熒光染色為陰性，此結果符合HTFs特性且無上皮細胞污染。

四、HTFs的細胞周期

細胞周期檢測結果顯示，第3～4代HTFs中(63.48±10.22)%處于G0/G1期，(10.80±5.07)%處于G2/M期，(24.34±8.07)%處于S期(圖4)。PI為35.6%，細胞增殖活性好。

討 論

HTFs在青光眼濾過術后濾過道瘢痕化的過程中扮演著重要的角色，HTFs的活化、遷移、增殖，及其合成分泌細胞外基質(zhì)等都是濾過泡瘢痕化的重要機制[2，3]。因此HTFs的成功培養(yǎng)是研究濾過泡瘢痕化的重要基礎。

HTFs為間質(zhì)來源細胞，間質(zhì)來源的細胞含有波形蛋白(Vimentin)[7，8]，但在Tenon’s囊組織取材、培養(yǎng)的過程中很有可能混入結膜上皮細胞，結膜上皮細胞的沾染會影響細胞純度及后續(xù)實驗研究。因此我們采用免疫熒光的方法檢測所培養(yǎng)細胞的性質(zhì)和來源，通過檢測HTFs的陽性指標Vimentin蛋白以及結膜上皮細胞的陽性指標Cytokeratin蛋白，同時采用DAPI進行細胞核染色標記，以此來計算陽性細胞比例(陽性細胞/總細胞×100%)。經(jīng)驗證，本研究中所培養(yǎng)的原代細胞的Vimentin陽性細胞比例達98%，Cytokeratin為陰性。本研究中所培養(yǎng)的細胞胞體呈長梭形，可有2～3個突起，與HTFs的典型形態(tài)學特征一致。因此，本研究中培養(yǎng)的細胞是HTFs。

活細胞可通過線粒體能量代謝過程中琥珀酸脫氫酶的作用使淡黃色的MTT分解產(chǎn)生藍色結晶狀甲瓚沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，且形成甲瓚的量與細胞活性成正比，測定細胞活性水平可以間接反映細胞增殖的情況，MTT法是一種重要的測定細胞增殖活性的技術方法[9]。本研究采用MTT法對HTFs的生長情況進行了檢測，并繪制了細胞生長曲線，得出HTFs在傳代接種后3～5 d生長旺盛，適合后續(xù)研究。同時，流式細胞儀檢測細胞周期結果提示對數(shù)生長期的HTFs增殖指數(shù)為35.6%，細胞增殖活性好。

組織塊貼壁培養(yǎng)法是一種應用已久的原代細胞培養(yǎng)方法，但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下Tenon’s囊植塊不易貼壁，加入培養(yǎng)基后極易浮起，從而導致細胞培養(yǎng)失敗。因此，我們在傳統(tǒng)組織塊貼壁培養(yǎng)法的基礎上進行了優(yōu)化改進以提高培養(yǎng)效率。優(yōu)化組織塊貼壁培養(yǎng)的方案主要包括以下幾點：(1)術中顯微鏡下取材，避免收集的組織中混有結膜上皮組織，此方法可大大提高原代培養(yǎng)細胞的純度；(2)20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊后傾斜培養(yǎng)皿小心吸棄培養(yǎng)液，使組織塊自然、均勻的平鋪于培養(yǎng)皿底部，這樣組織塊可以保持在液體環(huán)境下的舒展狀態(tài)貼合培養(yǎng)皿底，貼合更加緊密；(3)組織塊表面滴加FBS有利于組織塊粘附培養(yǎng)皿底；(4)少量分次添加培養(yǎng)液可防止組織塊浮起；(5)原代細胞長出后采用半換液法進行培養(yǎng)，可以避免植塊及新生細胞生長微環(huán)境較大的變化。本研究的原代HTFs培養(yǎng)方法較好的解決了Tenon’s囊組織貼壁困難的問題，具有方法簡單、無需額外添加促生長細胞因子、操作步驟少、污染機會少等優(yōu)點。

總之，該方法能獲得純度高、活力好的原代人Tenon’s囊成纖維細胞，是一種簡單、經(jīng)濟、有效的人原代Tenon’s囊成纖維細胞培養(yǎng)方法，為研究青光眼濾過泡瘢痕化提供了可靠的靶細胞模型。