DNA條形碼技術及其在法醫(yī)學中的應用展望

（1.遵義醫(yī)科大學法醫(yī)學院，貴州 遵義 563000；2.湄潭縣公安局，貴州 湄潭 564100；3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院司法醫(yī)學鑒定中心，貴州 遵義 563000）

DNA條形碼（DNA barcode）是指在生物體中具有代表性的DNA片段，其有足夠的變異，相對較短且容易擴增[1]。DNA條形碼技術作為一種新興的輔助物種分類技術，為分類學研究提供了一個新的方向，在生物學、醫(yī)藥、食品衛(wèi)生、法醫(yī)學等領域有著廣泛的應用前景[2]。在與法庭科學相關的動植物、微生物以及昆蟲學研究中，通過DNA條形碼的使用，能夠為案件的偵破提供有利的方向，有望在未來的法醫(yī)學應用中發(fā)揮重要作用。

1 DNA條形碼技術的概述

2002年4月，德國科學協(xié)會就提出了構(gòu)建包括所有生物種群DNA序列的分類系統(tǒng)的想法[3]；2003年，HEBERT等[4]正式公布了DNA條形碼在動物識別中的應用價值，引起了世界各地分類學家的廣泛關注。此后，DNA條形碼成為生態(tài)研究的重要工具，不僅用于物種鑒定，也為生物學家進一步了解生態(tài)系統(tǒng)中的相互作用提供了依據(jù)[5]。我國于2005年開始DNA條形碼的研究，主要以水蚤、蚊類、寄生蟲、吸蟲、線蟲、粉虱等為主要研究對象，隨后拓展到昆蟲、漁業(yè)、中藥材鑒定等多角度多領域的使用[6]。

DNA條形碼研究的核心和熱點問題主要是對通用序列的篩選和鑒定，在對候選序列的PCR擴增效率和測序質(zhì)量進行初步評估后，需要對候選序列行進一步的效價評估。判斷DNA條形碼序列好壞的標準之一是序列是否發(fā)生足夠多的遺傳變異來區(qū)分物種，而其內(nèi)部的變異是足夠少的。因此，理想的DNA條形碼應該是物種間變異程度大于種內(nèi)變異程度[7]。結(jié)合已成功研究的動物和植物DNA條形碼成果，評價種內(nèi)種間變異的方法主要有遺傳距離分析、遺傳相似度分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析、序列特征分析以及統(tǒng)計分類法分析等[2]。迄今為止，已有大量成熟的DNA條形碼網(wǎng)站，如國際上的生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BOLD，http://www.boldsystems.org/views/login.php）和我國的中國植物志（Flora of China，http://www.efloras.org/flora_page.aspx?flora_id=2）等可供參考使用。

2 DNA條形碼技術的原理

DNA是生物遺傳信息的載體。由于每個物種的DNA序列都是獨特的，DNA條形碼可通過測定一段標準的并且在基因組上有足夠變異的特定DNA序列來識別此物種。從理論上講，這種標準的DNA序列對于每個物種來說都是獨一無二的。由于每個位點有A、T、G和C 4種堿基，一段長15bp的DNA序列即可編碼近10億個序列。理論上，DNA序列可以編碼地球上絕大多數(shù)的生物，從而在生物鑒定中發(fā)揮作用。

DNA條形碼技術是基于傳統(tǒng)的DNA序列標記技術，在概念上類似于基因分型，可以現(xiàn)有的基因分析技術為依托，與分類研究、遺傳譜系、系統(tǒng)發(fā)育有一定的相關性[3]，主要通過對一系列來自不同生物個體的短同源DNA序列進行PCR擴增和測序，然后對被測序列進行比對和聚類分析，以準確定位到一個已描述過的分類種群中[8]。通過GenBank等數(shù)據(jù)庫進行序列比對是DNA聚類分析研究中的一個重要內(nèi)容，其序列比對軟件較多，算法各異，但基于動態(tài)規(guī)劃的多序列比對問題仍然十分復雜，不同算法的可靠性還需進一步驗證，而且數(shù)據(jù)預處理與特征提取對聚類分析影響較大。聚類算法基于其分類不同，隨著大數(shù)據(jù)和人工智能的發(fā)展，聚類算法應用廣泛，但同時要求更高，僅選擇一種聚類算法可能無法適用數(shù)據(jù)集的復雜性和多樣性。因此，需要在了解基本聚類算法優(yōu)缺點的基礎上，研究多種算法的融合問題[9-11]。對于某些物種，現(xiàn)已知的結(jié)構(gòu)特征已足夠?qū)⑵涠ㄎ坏教囟ǖ牡乩矸N群[12]，便于分析和歸類。

3 DNA條形碼技術的優(yōu)勢和局限性

DNA條形碼技術作為一種標準的物種鑒定方法，操作步驟簡單快速，具有廣泛的應用前景。當傳統(tǒng)的分類困難時，這種技術就更可以發(fā)揮其優(yōu)勢[13]。

DNA條形碼技術的優(yōu)點主要體現(xiàn)在如下幾點：（1）DNA條形碼技術是傳統(tǒng)識別技術的有效補充。傳統(tǒng)的分類學對一些形態(tài)相似的植物、部分中草藥的分類較為困難，而DNA條形碼技術可以不受形態(tài)、大小、完整性等理化因素的影響，直接從基因水平對物種進行快速鑒定，如余亞東等[14]使用ITS2序列對白術與蒼術及其混偽品進行了有效區(qū)分，避免了因形態(tài)學鑒定造成的誤差。這顯示了DNA條形碼具有較高的準確性，是分子生物鑒定的最新發(fā)展方向，特別是在傳統(tǒng)手段無法鑒定的卵和幼蟲以及動植物寄生蟲等方面，可以發(fā)揮獨有的優(yōu)勢[15-16]。（2）建立統(tǒng)一的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，有利于物種鑒定的規(guī)范化。（3）通過DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立，可快速識別大量樣本，從而促進分類學的快速發(fā)展。（4）DNA條形碼技術有利于新物種的開發(fā)利用。隨著瀕危動植物的增多，尋找新的可替代資源已經(jīng)成為一個重要的方向。在許多藥用動植物中，DNA條形碼技術有利于尋找化學結(jié)構(gòu)相似、親緣關系較近、藥性藥效差別不大的新藥源，有利于新物種的開發(fā)和利用。（5）DNA條形碼技術有利于生物多樣性的保護。在快速完成物種區(qū)別和鑒定的同時，DNA條形碼技術也可以發(fā)現(xiàn)新物種和隱匿種，并且可以重建物種和高級分類階元的演化關系[17]。（6）DNA條形碼技術有助于緩解專業(yè)人員短缺的現(xiàn)狀。DNA條形碼技術程序固定、操作簡單，鑒定人員只需經(jīng)過短期培訓即可通過構(gòu)建的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)比對，緩解了目前鑒定人才缺乏的狀況。（7）DNA條形碼技術可為物種的流通管理帶來新的變革。DNA條形碼使用二維碼作為DNA序列的信息載體，并利用目前已普及的掃描功能的通信終端以及全面覆蓋的無線網(wǎng)絡技術，促使待鑒定物種的信息收集與傳輸都變得更加簡單、快捷[18]。DNA條形碼技術作為一種新的物種識別方法，能夠以一種移動的方式實現(xiàn)物種信息的采集和識別，是一種理想的物種鑒別技術，必將為未來物種的鑒定帶來便利。

當然，DNA條形碼也存在一些局限性。地球上物種繁多，有效數(shù)據(jù)資料匱乏，而被DNA條形碼編碼的數(shù)據(jù)資料更少。首先，針對不同的鑒定目的，條形碼基因組區(qū)域的選擇不同。不同物種及同種亞型DNA條形碼的選擇差異也較大，如COⅠ基因?qū)游镂锓N鑒定而言是一個有效的DNA條形碼基因，植物DNA標準條形碼的核心基因片段是rbcL/matK，真菌則是ITS基因。針對物種的特異性可選擇不同的DNA片段來進行種屬鑒定。不同區(qū)域的進化保守程度不同，采用單一基因片段鑒定有限，必要時可聯(lián)合使用多個DNA片段、多種方法綜合鑒定[19-20]。其次，由于世界各地科學家使用的擴增引物不統(tǒng)一，得到的部分數(shù)據(jù)有差別，不具有可比性，難以起到物種比對鑒定的目的[15]。另外，由于不同國家的科學家對物種的命名有差異，導致數(shù)據(jù)庫中資料混雜，在實際應用中也會引起混淆，給鑒定工作帶來困難。但是，通過建立統(tǒng)一的DNA條形碼聯(lián)盟和DNA條形碼網(wǎng)站，可對優(yōu)化DNA條形碼技術的應用起到積極的作用。

4 DNA條形碼技術的法醫(yī)學應用前景

在法庭科學的種屬鑒定中，傳統(tǒng)的形態(tài)學、血清學和廣泛應用的商品化膠體金試劑條法都有各自的不足，在實際案件應用中不太理想。DNA條形碼技術作為物種鑒定的最新技術，在與法醫(yī)學鑒定有關的動植物、微生物、昆蟲以及其他方面可為法庭科學中涉及的非人類DNA鑒定提供新途徑和新思路。

4.1 與法醫(yī)學鑒定有關的動植物

隨著分子技術的發(fā)展，DNA條形碼技術彌補了動植物學主要依靠形態(tài)和性狀進行分類鑒定的不足。DNA條形碼技術作為分子鑒定的最新發(fā)展，其技術成熟，能夠客觀、準確、快速地進行物種鑒定。與法醫(yī)學鑒定相關的有毒動植物來源廣泛、種類繁多。我國目前已發(fā)現(xiàn)的有毒動物有上百種之多，常見的毒蛇、毒蜘蛛、蜈蚣、蜂以及可食用的河豚、斑蝥、蟾蜍等動物所含的毒素進入人體可引起中毒，甚至死亡[21]。在對這類物種進行鑒別時，往往依靠患者描述或者醫(yī)生經(jīng)驗進行推斷，具有一定的局限性，同時有些毒素在體內(nèi)釋放快，神經(jīng)毒性、循環(huán)毒性擴散快，危險大，需要盡快判斷，搶救生命。在疑為有毒動物中毒的案例中，搜集可疑動物標本進行檢測及物品識別，判斷有毒動物種類、性質(zhì)、來源與歸屬，協(xié)助法醫(yī)鑒定，將在法庭審理中起到很好的協(xié)助作用[22]。在法醫(yī)學鑒定中涉及可疑植物中毒分析時，依靠性狀或顯微觀察結(jié)果有很大的局限性，且費時費力，若能憑借植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可實現(xiàn)快速檢索和鑒定，并與案件調(diào)查相結(jié)合，進行綜合分析判斷[23]，有利于查清案件事實，為案件的快速偵破提供保障。宏條形碼（metabarcoding）技術是綜合DNA條形碼和高通量測序方法快速評估生物多樣性的新技術，可對浮游植物進行快速準確的鑒定[24]。在溺死案件中，對硅藻的種屬鑒定可對死亡原因以及入水地點進行鑒定，是法醫(yī)學實驗室診斷溺死的金標準[25]。若能將DNA條形碼技術與硅藻種屬鑒定相結(jié)合，必然能夠縮短檢驗時間，提高鑒定精準度，為案件偵破提供有利幫助。此外，在交通肇事案件中，植物DNA條形碼也可發(fā)揮重要作用，提供可靠的鑒定意見[26]，協(xié)助案件快速偵破。

4.2 與法醫(yī)學鑒定有關的微生物

人體內(nèi)外存在著大量的微生物，在漫長的進化過程中，雙方形成了互利共生的關系[27]。不同的身體部位有著不同種類的微生物，微生物在不同個體間也因年齡、性別、飲食、職業(yè)、衛(wèi)生習慣甚至個體基因的差異有所不同。傳統(tǒng)的微生物鑒定主要用于流行病學調(diào)查，隨著案犯反偵察能力的提高，為追蹤犯罪者的法庭微生物學應運而生。2015年美國哈佛大學研究表明，人類的微生物，特別是胃腸道微生物，有可能成為指紋識別工具；隨后發(fā)表在Proceedings of the National Academy of Sciences上的一項研究發(fā)現(xiàn)，每個人都有一個獨特的“微生物聚居群”，可以用來進行身份鑒定[28]。有學者[28-29]認為，無需人類DNA，利用人體微生物的DNA序列也有可能形成同樣的關聯(lián)，可應用于法醫(yī)學鑒定。由于細菌和人體之間的密切關系，當犯罪嫌疑人作案后，遺留在現(xiàn)場的微生物和其指紋一樣，是獨一無二的。研究[30-32]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人手上的細菌不受溫度、濕度和紫外線的影響而改變。因此，當現(xiàn)場的常規(guī)生物檢材無法提供有效的信息時，可以利用嫌疑人遺留在現(xiàn)場的細菌譜進行DNA分析，并與嫌疑人身上或者手上的微生物譜進行比對，為追蹤犯罪嫌疑人提供科學依據(jù)。

由于中國的近親屬常呈聚居式生活，具有相同的生活環(huán)境和飲食習慣，皮膚表面的微生物可具有一定的相似性。在實際檢案中，除了可以利用微生物的DNA條形碼進行犯罪嫌疑人的相關信息分析，也可以根據(jù)檢測到的微生物群進行相關親屬的比對。檢測相近微生物株間可靠變異，推測特定微生物來源、親緣關系或傳播途徑，可為縮小偵查范圍提供有利的證據(jù)[33]。

此外，不同的土壤、植物可孕育出不同的微生物，自然界中的土壤-植物-微生物具有相互作用[34]。在刑事案件中，對遺留在現(xiàn)場或者無名尸體上的微生物可通過DNA條形碼技術進行檢測，判斷其優(yōu)勢菌落組成，對尋找第一案發(fā)現(xiàn)場提供方向，可大大縮短偵查范圍，提高破案效率。另外，對死后尸體上微生物的代謝變化，利用DNA條形碼技術檢測其微生物簡單易行、快速準確，可為死亡時間、死亡地點提供科學依據(jù)。

4.3 與法醫(yī)學鑒定有關的昆蟲

昆蟲證據(jù)在案件偵破和法庭審判中起到不可忽略的作用[35]。昆蟲的種類、發(fā)育歷期、地理分布、適生場所、行為規(guī)律等都可以用來推斷死亡時間、死亡地點、死亡原因等，為案件的調(diào)查提供有利方向。對法醫(yī)學有意義的昆蟲主要有雙翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲、膜翅目昆蟲以及其他節(jié)肢動物等[36-37]。由于死亡現(xiàn)場的昆蟲標本采集通常受到土壤、地形、植被等因素的影響，加之破案時間短、牽涉范圍廣、任務重以及技術人員專業(yè)知識有限，容易影響鑒定意見的準確性，同時，由于親緣關系比較近的物種因化學成分相似而難以區(qū)分，尤其是一些蟲卵、幼蟲等難以使用傳統(tǒng)的方法進行有效鑒別[38]。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，DNA條形碼技術用較短的、標準的DNA片段作為遺傳標記進行物種鑒定，不受個體大小、生長階段及組織細胞完整性的影響，能直接從基因水平提供豐富的鑒定依據(jù)[39]。翟仙敦等[40]使用DNA條形碼技術對5種嗜尸性麻蠅進行分類，其鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。由此可見，DNA條形碼作為傳統(tǒng)形態(tài)學的重要補充，在法庭科學DNA鑒定中具有實用價值。

4.4 法庭科學中的其他應用

法庭科學的目的是從證據(jù)鏈中提取相關信息，使發(fā)生的事件得以精確地重現(xiàn)，確保案件的真實客觀性。明確檢材的種屬分類至關重要，能為案件偵查提供線索以及案件審理提供證據(jù)[41-42]。隨著生命條形碼數(shù)據(jù)庫的不斷補充，在一些如違法捕殺和買賣受保護瀕危動植物的案件中，明確該動植物的保護級別，對維護經(jīng)濟市場穩(wěn)定有較大作用[43]，DNA條形碼技術的實用性也愈發(fā)明顯。另外，在國境口岸可利用DNA條形碼技術對病媒生物、疫病疫情進行防控，解決生物犯罪，保障國家安全[44]。還可利用DNA條形碼技術對海關貿(mào)易進行監(jiān)測，保障進出口貿(mào)易安全有序進行[45]。目前，已有DNA條形碼技術與DNA芯片相結(jié)合的實際應用案例，為建立高通量、低成本、快速、準確、靈敏的成套檢測技術奠定了基礎，顯示了該技術良好的應用前景[46]。

DNA條形碼技術不僅促進了傳統(tǒng)分類學研究的發(fā)展，同時也加快了生物資源的鑒別、收藏工作，推進了生物資源的合理利用。法醫(yī)學作為法律與自然科學的交叉學科，在利用其他學科成熟技術的前提下，必然也會得到相應的發(fā)展和提高。隨著二代測序所伴隨的大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，法庭科學中的DNA條形碼技術也會得到重視，有望在未來的法醫(yī)學實踐中發(fā)揮重要的作用。