低谷蛋白水稻的淀粉顆粒掃描電鏡觀察及RVA譜特征研究

郭 濤，張煥霞，薛 芳，王海鳳，姜艷芳，房文文，林香青，張士永

（山東省水稻研究所/山東省水稻工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100）

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物之一，種植面積大約占全部耕地面積的1/4，產(chǎn)量大約占糧食總產(chǎn)量的1/2。水稻種子主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成，淀粉含量占粒重的75%以上，蛋白質(zhì)含量占粒重的7%～10%。水稻種子儲(chǔ)藏蛋白是以稻米為主食人群的蛋白重要來源，依據(jù)其溶解特性可分為水溶性清蛋白、醇溶性蛋白、鹽溶性球蛋白和可溶于稀酸或稀堿的谷蛋白。水稻種子中谷蛋白是最主要的儲(chǔ)藏蛋白，占稻米總蛋白的60%～80%，是最容易被人體吸收的蛋白[1]。因此，提高谷蛋白含量能增加稻米中可吸收蛋白的含量，提升稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，對(duì)于慢性腎臟病患者和并發(fā)腎臟機(jī)能損害的糖尿病患者，需要對(duì)蛋白質(zhì)的攝入進(jìn)行嚴(yán)格控制，攝入過高的可吸收性蛋白會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)，加速腎臟功能的衰退，導(dǎo)致病情惡化[2]。近年來，隨著人們生活水平提高和飲食方式突然改變，腎臟病和并發(fā)腎臟機(jī)能損害的糖尿病患者人數(shù)的不斷增加，低蛋白含量食品的市場(chǎng)需求越來越大。所以，培育低谷蛋白含量的水稻品種，滿足特殊人群飲食需求，已成為水稻育種的一個(gè)熱點(diǎn)[3]。

目前，國(guó)內(nèi)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)已利用引進(jìn)LGC-1 資源材料或新創(chuàng)制的低谷蛋白材料，培育出適合當(dāng)?shù)胤N植的低谷蛋白水稻新品種（系）。山東省水稻工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室前期引進(jìn)了攜帶LGC-1 基因的HNG1種質(zhì)資源，并將該基因定向?qū)氲絻?yōu)良食味米品種圣稻735，培育出谷蛋白含量與資源材料相當(dāng)?shù)倪m宜黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白水稻新品種[4]。但目前還未有關(guān)于谷蛋白含量降低對(duì)稻米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及淀粉RVA譜（rapid viscosity analyzer，RVA）的研究報(bào)道。山東省水稻工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)利用前期培育的低谷蛋白水稻新品種圣稻LG03，通過比較其與背景親本圣稻735 的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)、淀粉RVA譜特征，以期為闡明谷蛋白含量與淀粉結(jié)構(gòu)及品質(zhì)的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源庫(kù)的低谷蛋白粳稻新品系2054為L(zhǎng)GC-1 供體，與本實(shí)驗(yàn)室自育的優(yōu)良食味水稻品種圣稻735 雜交、回交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，選育出食味品質(zhì)優(yōu)良的低谷蛋白新品系圣稻LG03[4]。

1.2 圣稻LG03 農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀調(diào)查

試驗(yàn)于2017年在山東省水稻研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。5月11日播種，6月26日移栽。單株材料株行距13 cm×26 cm，每行10株，每個(gè)材料種植5 行，用于調(diào)查農(nóng)藝性狀；小區(qū)材料株行距16 cm×26 cm，每穴3～4 苗，小區(qū)面積13.33 m2，每個(gè)材料種植3個(gè)小區(qū)，用于考察產(chǎn)量。

全區(qū)水稻籽粒90%以上的實(shí)粒黃熟為成熟日期，從播種日至成熟日的天數(shù)為全生育期。水稻成熟期隨機(jī)選取5個(gè)單株，分別考察株高、穗長(zhǎng)、主莖穗穗總粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)，取平均值。脫粒后考察1 000 粒飽滿籽粒的重量，重復(fù)兩次，取平均值。分小區(qū)收獲各材料，稱重，測(cè)量水分，換算成14.5%含水量重量，取平均值，計(jì)算產(chǎn)量。

稻谷收獲后，室溫放置90 d，待品質(zhì)穩(wěn)定后加工成精米，計(jì)算精米率（鋒速LTJM160 型精米機(jī)，上海青浦綠洲檢測(cè)儀器有限公司）；用食味計(jì)測(cè)定精米蛋白質(zhì)含量和直鏈淀粉含量（RCTA-11A 型，日本佐竹公司），實(shí)驗(yàn)兩次重復(fù)，取平均值。稻瘟病抗性由天津市植物保護(hù)研究所鑒定。種子總蛋白提取采用SDS-PAGE 分析，具體參照郭濤等[4]實(shí)驗(yàn)方法和步驟。

1.3 淀粉顆粒掃描電鏡觀察

1.3.1 材料準(zhǔn)備 將材料加工成精米，夾在開叉的鑷子上，用刀背在樣品的中部施壓，使其自然斷裂，用小刀切下斷裂部分，制成3 mm 厚的樣品，斷面上用IB-23 型離子濺射儀噴鍍金粉；

1.3.2 電鏡觀察 噴金后的斷面用SUPRATM55 熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察淀粉顆粒形狀及結(jié)構(gòu)，并拍照。電鏡加速電壓為5.0 kV。

1.4 淀粉RVA譜特征測(cè)定

將精米研磨成粉末（MM400 型，德國(guó)萊馳），過100 目篩子后備用。采用Perten 公司生產(chǎn)的StarchMaster 2 型RVA（rapid viscosity analyzer）快速測(cè)定，測(cè)定方法參照郭濤等[5]試驗(yàn)方法和步驟。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

表型數(shù)據(jù)均以該性狀的平均值作為最終數(shù)值，用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0 分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣稻LG03 農(nóng)藝性狀及部分品質(zhì)性狀考察

考察新培育的低谷蛋白品種圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀，每個(gè)材料調(diào)查5 穴，結(jié)果由表1可知，生育期、稻瘟病抗性無顯著差異（P＞0.05），與親本圣稻735 相比，圣稻LG03株高、穗總粒數(shù)、穗實(shí)粒數(shù)顯著降低（P＜0.05），而千粒重、折合產(chǎn)量、穗長(zhǎng)、直鏈淀粉含量略有升高，精米率、蛋白質(zhì)含量等性狀略有降低，無顯著差異（P＞0.05）。田間觀察長(zhǎng)勢(shì)一致，無顯著差異。

表1 圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀比較

2.2 圣稻LG03 蛋白成分測(cè)定

圣稻LG03 與圣稻735 籽粒中總蛋白含量差異不大。利用SDS-PAGE 凝膠分析，考察材料儲(chǔ)藏蛋白的組成，結(jié)果如圖1 所示，圣稻LG03 的谷蛋白（包括谷蛋白前體、谷蛋白酸性亞基、谷蛋白堿性亞基）各條帶較背景親本圣稻735 均顯著減少，與供體親本HNG1 相當(dāng)；圣稻LG03 中的醇溶蛋白比例顯著提高，球蛋白含量略有增加。

2.3 谷蛋白含量降低對(duì)淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的影響

圣稻LG03 的稻米外觀品質(zhì)與背景親本圣稻735無顯著差異，籽粒外觀表現(xiàn)透明，加工品質(zhì)（糙米率、精米率和整精米率）無明顯變化。利用熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡在500 倍、1 000 倍和2 000 倍的視野下觀察精米橫斷面的腹部、中部和背部淀粉顆粒形狀及結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2 所示，圣稻LG03 與圣稻735 的胚乳主要由復(fù)合淀粉顆粒組成，細(xì)胞充實(shí)飽滿、無縫隙，淀粉顆粒，多面體，棱角分明，相互鑲嵌，排列緊密；但與圣稻735 相比，圣稻LG03 的淀粉顆粒大小一致性較低，部分淀粉顆粒變小。結(jié)果表明，谷蛋白含量降低，對(duì)淀粉顆粒大小的一致性會(huì)產(chǎn)生一定的影響。

2.4 谷蛋白含量降低對(duì)淀粉RVA譜特征值的影響

由圖3和表2可知，圣稻LG03 的谷蛋白含量降低，淀粉RVA 圖譜整體呈下降趨勢(shì)，峰值黏度、熱漿黏度和冷膠黏度均顯著減少。圣稻LG03 的崩解值和糊化溫度降低，說明其淀粉顆粒的高溫穩(wěn)定性降低，這可能與其淀粉顆粒大小一致性降低有關(guān)；回復(fù)值和消減值增加，表明淀粉顆粒持水能力降低，回生性增加。到達(dá)峰值黏度的時(shí)間差異不大。

3 討論

稻米胚乳是人們食用的主要成分，主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成。水稻種子儲(chǔ)藏蛋白含量占粒重的7%～10%，是以稻米為主食人群的蛋白重要來源。稻米中儲(chǔ)藏蛋白依據(jù)其溶解特性可分為溶于水的清蛋白（albumins），溶于稀鹽溶液的球蛋白（globulins），溶于醇溶液的醇溶蛋白（prolamins）和溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白（glutelins）。 谷蛋白占總貯藏蛋白的60%～80%，含量最高，醇溶蛋白占20%～25%，清蛋白和球蛋白含量最低[6]。隨著人們生活水平提高和飲食習(xí)慣突變，腎臟病和并發(fā)腎臟機(jī)能損害的糖尿病患者越來越多，對(duì)于這類腎臟損傷患者而言，攝入過高的蛋白會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致病情惡化[2]。因此，研究蛋白含量低的水稻新品種，特別是培育容易被人體吸收的谷蛋白含量低的水稻品種，已越來越迫切。

日本科學(xué)家利用化學(xué)誘變手段得到一個(gè)種谷蛋白含量顯著降低的突變體NM67，利用該突變體培育出世界上第一個(gè)低谷蛋白含量水稻品種LGC-1，谷蛋白含量低于4%，與正常水稻品種相比，谷蛋白含量明顯降低[7]。國(guó)內(nèi)不同學(xué)者也利用該資源或新創(chuàng)制資源，培育出多個(gè)低谷蛋白含量的水稻新品系（種）。萬建民等[8]利用LGC-1 材料為母本，培育出了國(guó)內(nèi)第1個(gè)低谷蛋白水稻新品種W3660。陳達(dá)剛等[9]利用新培育的W3660 與優(yōu)良秈稻品種雜交、回交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將LGC-1 基因?qū)攵i稻品種五山絲苗，選育出一個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的秈型低谷蛋白水稻新品系。郭濤等[4]通過引進(jìn)資源，將LGC-1 基因定向?qū)雰?yōu)良食味米品種圣稻735，培育出適宜黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白水稻新品系。

表2 谷蛋白含量降低對(duì)淀粉RVA譜特征值的影響

蛋白質(zhì)含量與稻米食味品質(zhì)關(guān)系密切。蘭靜等[10]優(yōu)化了稻米蛋白提取方法，發(fā)現(xiàn)蛋白含量相近、食味評(píng)分不同的品種谷蛋白電泳譜帶無差異，而清蛋白電泳譜在70～105 kDa 處譜帶存在不同，認(rèn)為105 kDa是與稻米食味相關(guān)的譜帶，譜帶顏色越深，食味品質(zhì)越好。石呂[11]以一組導(dǎo)入G1 基因和sd1 基因的近等基因系為材料，研究了水稻精米蛋白質(zhì)含量與稻米品質(zhì)變化的關(guān)系，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量與食味值呈極顯著負(fù)相關(guān)，呈劣化稻米蒸煮食味品質(zhì)的顯著趨勢(shì)。

淀粉占水稻胚乳的60%以上，淀粉RVA譜特性是評(píng)價(jià)稻米品質(zhì)的重要指標(biāo)，與蒸煮食味品質(zhì)密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)不同學(xué)者就稻米R(shí)VA譜特征值與稻米食味品質(zhì)的關(guān)系開展了許多研究[12-13]。舒慶堯等[12]研究認(rèn)為，稻米的直鏈淀粉含量與消減值、回復(fù)值、熱漿黏度和冷膠黏度呈顯著或極顯著正相關(guān)，與崩解值呈顯著負(fù)相關(guān)，公認(rèn)食味較好的優(yōu)質(zhì)品種往往崩解值大，而消減值很小，且多為負(fù)值；相反，食味差的品種崩解值往往較小，而消減值很大。胡培松等[13]建立了淀粉RVA 特征值與稻米蒸煮及食味品質(zhì)性狀的回歸定量分析模型，在測(cè)定出RVA 特征值后，就可以通過分析軟件自動(dòng)計(jì)算出直鏈淀粉含量和膠稠度的預(yù)測(cè)值，對(duì)稻米蒸煮品質(zhì)及食味品質(zhì)進(jìn)行快速鑒定。但到目前還未有關(guān)于谷蛋白含量降低對(duì)稻米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及淀粉RVA譜特征值影響的相關(guān)報(bào)道。本研究中，圣稻LG03 谷蛋白含量顯著降低，導(dǎo)致淀粉RVA譜整體下降，峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、糊化溫度、到達(dá)峰值黏度時(shí)間均較圣稻735 減少，而回復(fù)值和消減值增加，這可能是由于谷蛋白減少導(dǎo)致的淀粉顆粒大小均勻度降低引起的，雖然電鏡觀察兩者間淀粉顆粒形態(tài)無顯著變化。下一步工作中，需通過考察不同灌漿階段的淀粉顆粒和蛋白體結(jié)構(gòu)，明確谷蛋白減少對(duì)淀粉顆粒和蛋白體的影響；考察谷蛋白降低對(duì)直鏈淀粉鏈長(zhǎng)及支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步闡明低谷蛋白水稻品質(zhì)變化的機(jī)理。

4 結(jié)論

圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀基本一致，谷蛋白含量顯著降低，淀粉顆粒大小均勻度降低，影響淀粉RVA譜特征值，使圣稻LG03 的峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、糊化溫度均降低，而回復(fù)值和消減值升高，食味品質(zhì)較圣稻735 略有降低。這為闡明谷蛋白含量與淀粉結(jié)構(gòu)及品質(zhì)關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王益華教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)藏蛋白分析提供的幫助。