蔗糖誘導(dǎo)擬南芥突變體rhd3合成花青素及基因表達(dá)分析

聶可心，李 微，李小龍，郭 嬡，張靠穩(wěn)，王 靜

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/國家民委生態(tài)系統(tǒng)建模及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021）

高等植物中，花青素是植物次生代謝產(chǎn)生的水溶性黃酮類色素，以苯丙氨酸為原料，經(jīng)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多酶復(fù)合體合成，后轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡儲(chǔ)存[1]?；ㄇ嗨赝ǔ７e累在葉、莖、花、果實(shí)以及種皮中，具有重要的生理作用?；ㄇ嗨乜墒怪参锘?、果實(shí)及種子色彩艷麗，以吸引昆蟲傳粉和覓食；能夠吸收紫外線防止植物受強(qiáng)光損傷；具有極強(qiáng)的還原性，可清除因脅迫產(chǎn)生的活性氧。對(duì)人類而言，花青素是一種天然、無毒的食用色素，且作為有效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗衰老等生理功能[2]，在食品、醫(yī)藥及保健品中應(yīng)用廣泛。因此，花青素的代謝調(diào)節(jié)一直是研究的熱點(diǎn)。

經(jīng)研究人員的多年努力，人類對(duì)花青素代謝過程的遺傳學(xué)和生物化學(xué)過程有了深入的認(rèn)識(shí)。擬南芥中花青素的合成涉及多步酶促反應(yīng)，編碼這些酶類的基因稱為結(jié)構(gòu)基因，包括苯丙氨酸裂解酶（AtPAL）、查爾酮合成酶（AtCHS）、查爾酮異構(gòu)酶（AtCHI）、黃烷酮-3-羥化酶（AtF3H）、二羥黃酮醇還原酶（AtDFR）和花青素合成酶（AtANS）等[3]。植物的發(fā)育階段、外部的環(huán)境變化，通過影響調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量。發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子有三類，即MYB、bHLH和WD40[4]。三類轉(zhuǎn)錄因子形成MBW 復(fù)合體，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響植物中花青素的含量[5]。其中，AtPAP1（MYB75）、AtPAP2（MYB90）、AtTT8（bHLH）、AtGL3（bHLH）、AtEGL3（bHLH）及AtTTG1（WD40）能夠響應(yīng)營養(yǎng)元素匱乏、強(qiáng)光、鹽及干旱脅迫，調(diào)節(jié)擬南芥中花青素的含量[6-8]。蔗糖（sucrose，Suc）能夠誘導(dǎo)花青素的合成。在發(fā)育的矮牽牛花冠中，蔗糖可誘導(dǎo)花青素合成通路的基因表達(dá)，促進(jìn)花青素的合成[9]。蔗糖可促進(jìn)葡萄中花青素的積累，其中信號(hào)分子Ca2+、蛋白激酶及磷酸酶發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[10]；蔗糖能夠調(diào)節(jié)擬南芥下胚軸及葉片合成花青素，使之呈現(xiàn)紫色，MYB 轉(zhuǎn)錄因子AtPAP1 直接參與這個(gè)過程[11]。此外，擬南芥合成花青素的過程還受到赤霉素（GA3）、乙烯等植物激素調(diào)控[12-13]。

擬南芥AtRHD3（root hair defective 3）編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)構(gòu)建，與擬南芥的生長發(fā)育緊密相關(guān)[14]。花青素合成過程中的結(jié)構(gòu)基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上形成多酶復(fù)合體，催化花青素的合成。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白基因AtRHD3 突變，能否影響花青素的合成尚不明確。本研究以蔗糖為誘導(dǎo)因素，比較擬南芥野生型Col-0 及突變體rhd3 中花青素的積累量，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析花青素合成通路中基因的表達(dá)差異，探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在花青素合成過程中的調(diào)控作用，為研究花青素的合成調(diào)控提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥野生型Col-0為本實(shí)驗(yàn)室保存、突變體rhd3（Salk_025215）為南開大學(xué)胡俊杰教授饋贈(zèng)。經(jīng)播種繁殖后，收獲突變體rhd3種子，經(jīng)LP、RP 及LBb1.3“三引物”PCR 法[15]進(jìn)行純合鑒定后，結(jié)果確定純合（圖1），方可使用。引物序列登錄SIGnAL（http：//signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html）查找獲得，序列如表1 所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料培養(yǎng) 培養(yǎng)基：5 mmol/L KNO3、1 mmol/L H3PO4、1 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2、1/2 微量元素、1/2 鐵鹽、1%瓊脂糖；蔗糖含量分別為0、1%、3%和5%，其中含1%蔗糖的培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基（CK）。

直接播種法：將野生型Col-0 及突變體rhd3種子用75%乙醇消毒后，平鋪于滅菌濾紙表面，晾干播種于含不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基表面，4℃春化3 d。置于培養(yǎng)室豎直光照培養(yǎng)7 d，每2 d 觀察1次。培養(yǎng)條件為25℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度125 μmol/（m2·s）。光照結(jié)束后，采集照片，測定花青素含量。

表1 引物列表

移苗法：將消毒后的野生型Col-0和突變體rhd3種子分別播種于對(duì)照培養(yǎng)基，4℃春化3 d。置于培養(yǎng)室垂直光照培養(yǎng)7 d，再分別將野生型Col-0幼苗和突變體rhd3 轉(zhuǎn)移到含不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基表面，繼續(xù)光照培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)條件為25℃，12 h光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度125 μmol/（m2·s）。光照結(jié)束后，采集照片，測定花青素含量。

1.2.2 花青素含量的測定 分別收集CK 及各蔗糖濃度處理組培養(yǎng)的野生型Col-0、突變體rhd3 幼苗地上部分，準(zhǔn)確稱取鮮重，置于200 μL 含1% HCl的甲醇溶液中，4℃黑暗過夜抽提，再加入150 μL ddH2O、150 μL 氯仿，混勻，4℃，12 000 r/min，離心5 min，吸取上清液，用酶標(biāo)儀分別測定每個(gè)樣品在530 nm 及657 nm處的吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次?；ㄇ嗨叵鄬?duì)含量的計(jì)算公式

式中，Q為花青素相對(duì)含量；FW為樣品鮮重（g）。

1.2.3 擬南芥總RNA 提取及cDNA 合成 采用移苗法培養(yǎng)植物材料，分別提取CK 及5%蔗糖處理的野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗的RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)RNA 提取效果后，取1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNA 提取及cDNA 合成分別選擇全式金TransZol Up 試劑盒與TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT、AtPAP1、AtPAP2、AtTTG1、AtTT8和AtMYBL2 在野生型Col-0 及突變體rhd3 中的表達(dá)量，以AtActin2為參照基因。首先，采用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)各基因的引物，如表1 所示。先通過常規(guī)PCR 分析各引物特異性，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用全式金TransStartRGreen qPCR SuperMix UDG 試劑，以2-△△Ct分析基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT、AtPAP1、AtPAP2、AtTTG1、AtTT8和AtMYBL2 在蔗糖誘導(dǎo)前后的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2×TransStartRGreen qPCR SuperMix UDG 10 μL，Primer F/R 各1 μL，cDNA 1 μL，超純水7 μL。實(shí)時(shí)熒光定量采用三步法，50℃2 min；94℃10 min；94℃5 s，60℃30 s（此環(huán)節(jié)40個(gè)循環(huán)）；于60℃時(shí)采集熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對(duì)野生型Col-0 及突變體rhd3花青素積累的影響

觀察直接播種法中不同濃度蔗糖對(duì)野生型Col-0及突變體rhd3 花青素積累，發(fā)現(xiàn)蔗糖會(huì)影響野生型Col-0 及突變體rhd3 下胚軸及葉片中花青素的含量（圖2a、圖2b），隨培養(yǎng)基中蔗糖濃度增加，直接播種的野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗下胚軸及葉片中紫色物質(zhì)花青素積累量增加，蔗糖含量濃度為3%時(shí)，即可見到突變體rhd3 下胚軸花青素積累，野生型Col-0 及突變體rhd3 花青素相對(duì)含量分別為5.34、8.75，突變體rhd3 中花青素含量顯著高于野生型Col-0。蔗糖濃度為5%時(shí)，野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗下胚軸及葉片中紫色物質(zhì)花青素積累量均達(dá)到最大值，分別為10.27、19.82，具有顯著差異（P＜0.05）。

待植物長至7 d，再分別將野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗移至含不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基中，幼苗下胚軸及葉片中花青素含量隨培養(yǎng)基中蔗糖濃度增加逐漸增加（圖2c、圖2d），當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為3%時(shí)，野生型Col-0 與突變體rhd3 中花青素含量分別為0.07/0.22，突變體rhd3 中花青素含量高于野生型Col-0。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為5%時(shí)，植株幼苗花青素含量達(dá)到最大值，突變體rhd3 中的花青素含量顯著高于野生型Col-0，分別為0.16/1.16（P＜0.05）。

2.2 花青素合成通路基因差異表達(dá)分析

分別提取對(duì)照培養(yǎng)及5%蔗糖處理的野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗的RNA，結(jié)果如圖3a 所示，28S 與18S 條帶清晰，可用于反轉(zhuǎn)錄。

以正常培養(yǎng)野生型Col-0 的cDNA為模板，對(duì)花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT及調(diào)控基因AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1、AtMYBL2進(jìn)行常規(guī)PCR，設(shè)計(jì)的9 對(duì)引物均能擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果如圖3b 所示，可用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的分析。

分析野生型Col-0 及突變體rhd3 中花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因的相對(duì)表達(dá)量，由圖4可知，對(duì)照培養(yǎng)的野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗中的

AtDFR、AtANS 及AtUF3GT 基因相對(duì)表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05），經(jīng)5 %的蔗糖處理后，3個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），在野生型Col-0 及突變體rhd3 中分別升高為對(duì)照培養(yǎng)時(shí)的5.0/16.0、3.8/13.2、38.4/78.4 倍。突變體rhd3 中，結(jié)構(gòu)基因的升高程度高于野生型Col-0。

分析野生型Col-0 及突變體rhd3 中花青素合成通路中調(diào)節(jié)基因的相對(duì)表達(dá)量，由圖5可知，正常培養(yǎng)的野生型Col-0 及突變體rhd3 幼苗中的AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1 基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)5%蔗糖處理后，4個(gè)調(diào)節(jié)基因均發(fā)生不同程度的上調(diào)，在野生型Col-0 及突變體rhd3 中AtPAP1、AtPAP2、AtTT8 及AtTTG1 分別上調(diào)至正常培養(yǎng)時(shí)野生型Col-0 的39.3/85.3、24.9/54.5、5.4/26.4，3.1/3.5 倍。其中3個(gè)調(diào)節(jié)基因在突變體rhd3 中的上調(diào)倍數(shù)顯著高于野生型Col-0（P＜0.05）。AtMYBL2 在花青素合成中起負(fù)調(diào)控作用，正常培養(yǎng)時(shí)，突變體rhd3 中AtMYBL2 基因的表達(dá)量顯著低于野生型Col-0 中的表達(dá)量（P＜0.05），僅為野生型Col-0 的0.6 倍，經(jīng)5%蔗糖處理，野生型Col-0 中AtMYBL2 基因表達(dá)量下降為對(duì)照時(shí)野生型Col-0 的0.6 倍，突變體rhd3 中AtMYBL2 基因的表達(dá)量下降至0.5 倍，持續(xù)較低水平表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

蔗糖是花青素合成的重要誘導(dǎo)因素。蔗糖不僅能夠促進(jìn)擬南芥幼苗花青素的合成，還可使黃酮含量升高[16]。本研究中，隨培養(yǎng)基中蔗糖含量的升高，野生型Col-0 中花青素的積累量升高。與野生型Col-0 相比，突變體rhd3 隨培養(yǎng)基中蔗糖含量的升高，會(huì)更早、更多積累花青素。結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白基因AtRHD3 在蔗糖誘導(dǎo)的花青素合成中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，90 mmol/L 的蔗糖能顯著誘導(dǎo)花青素合成通路中AtPAL、AtC4H、AtCHS、AtCHI、AtDFR、AtANS、AtUFGT 及AtPAP1 的表達(dá)[11]。AtPAP1 的表達(dá)量與花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因呈正相關(guān)。分子生物學(xué)試驗(yàn)證明，MYB可與bHLH 及WD40形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，結(jié)合在結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子區(qū)域，激活基因的表達(dá)，從而增加花青素的合成[17]。本研究中，5%的蔗糖能夠顯著誘導(dǎo)野生型Col-0 花青素合成通路中結(jié)構(gòu)基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT 及調(diào)控基因AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1 的表達(dá)，且這些基因在突變體rhd3 中表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）。因此，蔗糖處理后突變體rhd3 中參與花青素合成的基因的超量表達(dá)，是其花青素過量積累的重要原因。

AtMYBL2 是一個(gè)R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，在花青素合成過程中起負(fù)調(diào)控作用。除了受生長發(fā)育調(diào)節(jié)，AtMYBL2 的表達(dá)量與環(huán)境變化緊密相關(guān)，例如高光、低氮等均能影響基因的表達(dá)[18]。已有的研究表明，AtMYBL2 通過與AtTT8 結(jié)合，可形成抑制型L2BW 復(fù)合體，抑制花青素的合成。在植物的某一發(fā)育階段或受環(huán)境刺激后，MBW 與L2BW 的動(dòng)態(tài)含量，調(diào)節(jié)了花青素的含量[19]。蔗糖濃度升高可抑制AtMYBL2 的表達(dá)，有利于AtPAP1 與bHLH、WD40轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)花青素合成通路基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素積累。本研究中，突變體rhd3 的AtMYBL2表達(dá)量在正常及5%蔗糖處理時(shí)，均低于其在Col-0中的表達(dá)量。推測突變體中負(fù)調(diào)控因子的低表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體MBW 的形成，增加了突變體中花青素的合成。AtMYBL2 的表達(dá)量受植物激素GA3、乙烯等的調(diào)控，植物激素是否參與了突變體中過量積累花青素的過程，也是有趣的科學(xué)問題，是下一步研究的內(nèi)容。