2種大鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)模型在結(jié)膜抗瘢痕研究中的應(yīng)用比較

朱曉燕，胡 倩，李 東，李 浩，朱小敏，謝 琳 (.貴州省人民醫(yī)院眼科，貴州 貴陽(yáng) 55000；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科，重慶 400)

青光眼濾過(guò)手術(shù)是藥物控制不良的青光眼患者選擇的主要治療方式之一，術(shù)后濾過(guò)通道瘢痕形成是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因[1-2]。如何預(yù)防及減少瘢痕的形成是研究熱點(diǎn)之一，以往研究采用不同種屬的動(dòng)物和方法建立青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，如兔、猴等，但兔眼的解剖和基因與人眼差異較大，猴雖與人的種屬相近，但成本高、來(lái)源困難，限制了其應(yīng)用[3-6]。鼠眼基因序列與人眼同源性高，以其建立青光眼濾過(guò)手術(shù)模型更利于研究應(yīng)用。已有研究報(bào)道多種青光眼動(dòng)物模型的制備方式，鼠逐漸成為青光眼濾過(guò)手術(shù)的主要?jiǎng)游锬Ｐ椭籟7-9]。不同于兔、猴等動(dòng)物，鼠的眼球很小，無(wú)法完全模擬人青光眼濾過(guò)手術(shù)，常通過(guò)前房穿刺、結(jié)膜下注射、引流管植入等方法模擬青光眼濾過(guò)手術(shù)，但目前尚缺乏統(tǒng)一的濾過(guò)術(shù)模型建立方法。本研究擬通過(guò)前房穿刺法和前房植管法建立2種不同的大鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，比較其在青光眼術(shù)后抗瘢痕研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

顯微鏡(Leica，德國(guó))，石蠟組織切片機(jī)(Leica，德國(guó))，0.4%鹽酸奧布卡因(參天制藥有限公司，日本)，10%水合氯醛(生工，中國(guó))，靜脈穿刺微管系統(tǒng)(Fine Science Tools，美國(guó))，粘彈劑(博士倫，美國(guó))，Direct red 80(Sigma，美國(guó))，F(xiàn)ast green FCF(Sigma，美國(guó))，Picric acid(Sigma，美國(guó))，HE試劑盒(北京中杉，中國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))，數(shù)碼照相系統(tǒng)(SPOT，美國(guó))，超低溫冰箱(SANYO，日本)，臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Heraus，德國(guó))，掃描分析軟件系統(tǒng)(LabworksTM Analysis Software，美國(guó))，手術(shù)顯微鏡(蘇州六六，中國(guó))，Tonolab眼壓計(jì)(Icare，美國(guó))，眼科手術(shù)顯微器械(蘇州醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

雄性SD大鼠30只(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量200～250 g，SPF Ⅱ級(jí)。實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，遵從《善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2.1 大鼠濾過(guò)手術(shù)模型的建立[7,9]以大鼠右眼為手術(shù)眼，術(shù)前使用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液滴術(shù)眼3次，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.5%碘伏溶液常規(guī)消毒術(shù)眼周?chē)?.25%氯霉素滴眼液沖洗結(jié)膜囊3次。將大鼠隨機(jī)分為穿刺組和植管組，其中穿刺組15只15眼采用穿刺法，以角膜緣為基底，制作結(jié)膜瓣約2 mm×3 mm，將25G針頭于角膜緣平行虹膜面穿刺入前房，10-0縫線縫合結(jié)膜瓣；植管組15只15眼采用植管法，同樣制作結(jié)膜瓣，25G針頭穿刺入前房，植入靜脈穿刺微管(PE管)2～3 mm，一端植入前房，另一端埋于結(jié)膜下，于角膜緣固定縫合PE管1針，10-0縫線縫合結(jié)膜瓣。術(shù)后氯霉素滴眼液點(diǎn)術(shù)眼。

1.2.2 術(shù)后眼壓及濾過(guò)泡形態(tài)觀察 分別于術(shù)前及術(shù)后3 d、1周、2周、4周使用iCARE眼壓計(jì)測(cè)量并記錄眼壓，平均眼壓比=術(shù)后眼壓/術(shù)前眼壓×100%。觀察手術(shù)區(qū)結(jié)膜及角膜組織的充血水腫情況、濾過(guò)泡形態(tài)、前房情況等，若大鼠結(jié)膜感染或前房出血、感染等，則認(rèn)為模型建立失敗，每組建模成功10只以上。通過(guò)前節(jié)拍照觀察結(jié)膜濾過(guò)泡形態(tài)變化，記錄濾過(guò)泡維持時(shí)間及生存率。采用Image J 1.8.0軟件分析濾過(guò)泡面積，分別計(jì)算術(shù)后3 d及術(shù)后1周濾過(guò)泡的面積。濾過(guò)泡生存率=術(shù)后1周濾過(guò)泡面積/術(shù)后3 d濾過(guò)泡面積×100%，每組至少8只大鼠，計(jì)算后取平均值。

1.2.3 組織學(xué)觀察 于術(shù)后4周分別處死2組大鼠，摘取大鼠眼球置于眼球固定溶液(4%多聚甲醛、乙酸、冰醋酸)中固定24 h。平行視軸切去眼球的1/3，注意保護(hù)手術(shù)區(qū)域，繼續(xù)固定12 h，55%乙醇放置過(guò)夜，梯度乙醇(60%、70%、80%、90%、100%)脫水，二甲苯透明5 min，浸蠟1 h，進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片(5 μm)，37 ℃烤片過(guò)夜。石蠟切片分別行蘇木精-伊紅(HE)染色、苦味酸狼紅染色以觀察結(jié)膜切口的愈合情況及瘢痕形成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠濾過(guò)手術(shù)模型眼壓變化情況

因?qū)嶒?yàn)觀察中發(fā)生死亡或后期發(fā)生感染等導(dǎo)致部分模型失敗，完整模型每組10只。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量10只大鼠，2組術(shù)后3 d眼壓均明顯低于術(shù)前；穿刺組術(shù)后3 d至1周眼壓逐漸升高至術(shù)前水平，植管組術(shù)后2周眼壓逐漸升高至術(shù)前水平。穿刺組術(shù)后3 d、1周、2周、4周平均眼壓比分別為(73.01±18.89)%、(96.50±7.69)%、(105.51±11.65)%、(105.34±7.28)%，見(jiàn)圖1a；植管組術(shù)后3 d、1周、2周、4周平均眼壓比分別為(59.00±13.57)%、(69.61±11.48)%、(88.03±11.55)%、(98.10±11.61)%，見(jiàn)圖1b。僅術(shù)后1周2組平均眼壓比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)后3 d、2周、4周差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

a：穿刺組；b：植管組 平均眼壓比=術(shù)后眼壓/術(shù)前眼壓×100%

2.2 大鼠濾過(guò)手術(shù)后濾過(guò)泡形態(tài)變化

穿刺組大鼠術(shù)后3 d手術(shù)區(qū)結(jié)膜充血水腫，穿刺口角膜稍水腫，但濾過(guò)泡較扁平；術(shù)后1周形態(tài)扁平；術(shù)后2周、4周手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織無(wú)明顯充血，幾乎觀察不到濾過(guò)泡，前房同術(shù)前比較無(wú)明顯變化，晶狀體無(wú)明顯渾濁(圖2)。植管組大鼠術(shù)后3 d角膜穿刺口稍水腫，引流管在位，未接觸晶狀體，濾過(guò)泡隆起彌散，結(jié)膜組織充血水腫，前房可見(jiàn)少許滲出，部分少許積血，晶狀體無(wú)明顯渾濁；術(shù)后1周角膜透明，引流管在位，濾過(guò)泡隆起較穿刺組明顯；術(shù)后2周濾過(guò)泡逐漸局限，結(jié)膜組織包裹PE管末端，結(jié)膜表面血管化；術(shù)后4周僅觀察到濾過(guò)區(qū)結(jié)膜組織包裹PE管末端(圖2)。穿刺組濾過(guò)泡維持時(shí)間為3～5 d，平均(3.5±0.64)d；植管組為10～14 d，平均(12.5±1.85)d。濾過(guò)術(shù)后 1周植管組濾過(guò)泡的生存率(26.25±3.25)%高于穿刺組的(10.50±1.86)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=4.205)，見(jiàn)圖3。

2.3 大鼠濾過(guò)泡組織HE染色及苦味酸狼紅染色結(jié)果

術(shù)后4周，觀察2組手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織切片HE染色。穿刺組可見(jiàn)球結(jié)膜組織增厚，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增殖。植管組手術(shù)區(qū)放置PE管，切片可見(jiàn)管囊腔樣結(jié)構(gòu)，結(jié)膜組織仍有明顯的炎癥反應(yīng)，大量中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增殖較穿刺組明顯?？辔端崂羌t染色顯示手術(shù)區(qū)的膠原組織沉積情況，2組濾過(guò)手術(shù)區(qū)球結(jié)膜下均可見(jiàn)紅色膠原纖維沉積，PE管被結(jié)膜下致密的膠原組織包裹，未見(jiàn)明顯的濾過(guò)泡結(jié)構(gòu)(圖4)。

3 討論

濾過(guò)手術(shù)是治療青光眼的主要方式之一，功能性濾過(guò)泡的瘢痕形成是手術(shù)失敗的主要原因，如何維持濾過(guò)功能、減少或者延緩瘢痕的形成是研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。本研究通過(guò)觀察和對(duì)比前房穿刺法和植管法建立的2種大鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，觀察眼壓、濾過(guò)泡的形態(tài)與組織學(xué)改變，探討不同手術(shù)模型在青光眼濾

圖2 大鼠濾過(guò)手術(shù)后濾過(guò)泡形態(tài)變化

圖3 大鼠濾過(guò)手術(shù)后1周濾過(guò)泡的生存率

圖4 術(shù)后4周大鼠手術(shù)區(qū)組織HE染色及苦味酸狼紅染色(×100)過(guò)手術(shù)后結(jié)膜瘢痕形成研究中的應(yīng)用。

模擬抗青光眼手術(shù)的模型可采用不同種屬的動(dòng)物和方法建立，其中最常用的是兔子和鼠。兔子眼球較大，比較適合建立動(dòng)物研究的手術(shù)模型，易于手術(shù)操作和術(shù)后觀察，但兔眼的解剖結(jié)構(gòu)和基因與人眼相比有很多不同[5,10]。在非靈長(zhǎng)動(dòng)物中，鼠的眼球前房結(jié)構(gòu)與人最相似，具有小梁網(wǎng)和Schlemm管結(jié)構(gòu)，且鼠基因序列與人類(lèi)相似度高、成本較低，是模擬抗青光眼手術(shù)的理想模型[11-13]。Reichel等[14]首次使用小鼠模擬青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，使用27G針頭結(jié)膜下注射25 μL PBS，術(shù)后1～3 d小鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和成纖維細(xì)胞增生，7～14 d可觀察到結(jié)膜瘢痕的形成。Seet等[8]采用穿刺法構(gòu)建小鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，結(jié)果顯示術(shù)后14 d形成典型的瘢痕，絲裂霉素C處理后可延長(zhǎng)濾過(guò)泡生存時(shí)間至28 d。Sherwood等[11]利用30G導(dǎo)管制作大鼠青光眼濾過(guò)手術(shù)模型，認(rèn)為穿刺法濾過(guò)通道維持時(shí)間過(guò)短，不利于觀察瘢痕形成過(guò)程。本研究將2種手術(shù)方式進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)穿刺法操作簡(jiǎn)單，但穿刺通道太小，容易閉合，術(shù)后濾過(guò)泡不明顯且容易消失，不利于觀察濾過(guò)泡形態(tài)；而植管法通過(guò)微管將房水引流至結(jié)膜下，濾過(guò)泡維持相對(duì)穩(wěn)定，但手術(shù)操作較為困難，容易損傷晶狀體及虹膜，引起前房出血、引流管移位甚至脫落，因此植管法需要一定的操作經(jīng)驗(yàn)。術(shù)后測(cè)量大鼠眼壓觀察濾過(guò)泡形態(tài)變化，結(jié)果顯示植管法大鼠眼壓普遍較穿刺法低，且濾過(guò)泡形態(tài)維持時(shí)間更長(zhǎng)。

明佩佩等[15]采用前房引流管(硅膠管：內(nèi)徑0.3 mm、外徑0.6 mm)植入術(shù)制作大鼠眼球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周左右是結(jié)膜切口的愈合期，濾過(guò)泡生存時(shí)間為7～17 d，平均(11.93±2.23)d，術(shù)后2周內(nèi)結(jié)膜瘢痕形成最為關(guān)鍵，濾過(guò)泡生存率下降至20%，手術(shù)區(qū)結(jié)膜下成纖維細(xì)胞增生活躍，膠原纖維沉積，導(dǎo)致濾過(guò)泡瘢痕化。本研究中術(shù)后1周植管組濾過(guò)泡生存率為(26.25±3.25)%，分析原因可能與植入材料、手術(shù)操作、動(dòng)物本身等相關(guān)；植管組組織石蠟切片苦味酸狼紅染色結(jié)果顯示，手術(shù)區(qū)結(jié)膜下可見(jiàn)致密的膠原纖維沉積，提示手術(shù)后1～2周是瘢痕形成的關(guān)鍵期。

目前引入一種新的青光眼引流管微創(chuàng)植入裝置(XEN凝膠引流管：長(zhǎng)6 mm，管內(nèi)徑約45 μm)，這種新型的引流管手術(shù)更微創(chuàng)，術(shù)后反應(yīng)更輕，生物相容性好，但術(shù)后仍面臨結(jié)膜瘢痕形成導(dǎo)致手術(shù)失敗等問(wèn)題，第一代產(chǎn)品在不使用抗代謝藥物的情況下術(shù)后失敗率為50%～80%[16-17]。Vera等[18]認(rèn)為加強(qiáng)青光眼患者手術(shù)前后抗炎治療，減少結(jié)膜組織炎癥反應(yīng)，使用抗代謝藥物有助于減少結(jié)膜瘢痕形成。如何預(yù)防和減少術(shù)后結(jié)膜瘢痕形成仍然是目前青光眼手術(shù)治療的一大難題，本研究中在前房植入PE管以引流房水、降低眼壓，與XEN凝膠引流管手術(shù)原理類(lèi)似，可為相關(guān)藥物研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究選擇大鼠作為青光眼濾過(guò)手術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕化研究的動(dòng)物模型，采用前房穿刺法和植管法模擬青光眼濾過(guò)手術(shù)。2種方法均可形成結(jié)膜濾過(guò)通道，與穿刺組相比，植管組術(shù)后眼壓更低，濾過(guò)泡形態(tài)明顯，術(shù)后1周濾過(guò)泡的生存率更高，利于術(shù)后觀察瘢痕形成的過(guò)程，可為青光眼術(shù)后抗瘢痕干預(yù)提供較理想的動(dòng)物模型。