急性胰腺炎大鼠模型白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的表達及聯合檢測的意義

呂 芳，王松巖，張麗英，尚少紅，羅燕青

（北京市石景山醫(yī)院，北京 100043）

急性胰腺炎主要的臨床表現為腹痛、腹脹、麻痹性腸梗塞等，嚴重的情況下也會引起全身炎癥反應綜合征，且發(fā)病快，死亡率高，可達30%以上，但是發(fā)病的具體機制不明確［1］。要想做到急性胰腺炎的早診斷就要對急性胰腺炎嚴重程度進行正確的評估，從而抓住治療時機，提出有效的治療方法，對患者預防并發(fā)癥具有重要意義，同時也可以提高患者預后的生存質量［2］。白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α作為炎性因子，在炎性反應中發(fā)揮著重要的作用。近年來，許多專家學者專注于研究急性胰腺炎的發(fā)病機制，希望從中找到治療急性胰腺炎的新方法［3］。本文通過建立急性胰腺炎大鼠模型，研究白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的表達及聯合檢測的意義。

1 資料與方法

1.1 材料研究動物：選取50 只健康大鼠，由我院動物研究中心提供，雌雄不限，鼠齡2.8～6.2 月，平均鼠齡（3.4±1.7）月，體重200～250g，平均（220±7.9）g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈的籠子里，室溫在（22.0±2.1）℃，相對濕度35%～40%，每天12 個小時光照，喂飲大鼠純凈水。經過一周飼養(yǎng)時間后，隨機分為正常組和模型組，各25 只。兩組大鼠在年齡以及體重上均無統(tǒng)計學差異，具有可比性，所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 模型建立模型組25 只大鼠手術前要禁食12h，正常飲水。使用10%的水合氯醛配置溶液，進行腹腔注射，劑量為0.5mL/100g，麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定后，需要進行手術的區(qū)域進行酒精消毒，取腹部正中切口，將皮膚和皮下筋膜切開，將腹腔暴露，找出胰腺組織和十二指腸，在接近肝門的膽總管使用血管夾夾閉，選擇4 號針頭將?；悄懰徕c經過十二指腸穿入到膽胰管5mm 處，注射時防止注射流入腸管，用手指按壓十二指腸的乳頭部位，緩慢勻速注入，之后會觀察到胰腺組織紅腫。當注射完成時，拔出針頭，將腸道恢復原來的位置，5min 后取出血管夾，腹腔關閉。建模成功大鼠總計20 只，所有建模成功的大鼠術后背部均皮下注射5mL 的生理鹽水，劑量為2mL/100g，8h/次，自由飲食。

1.2.2 大鼠小腸粘膜厚度、絨毛高度和上皮損傷檢測

手術后留取大鼠直徑為0.5～1.0cm，長度為10cm，使用5%的甲醛溶液固定后，經過石蠟包埋，使用蘇木素染色，在光鏡下檢測，檢查大鼠小腸粘膜厚度、絨毛高度并分析上皮損傷指數，進行病理學觀察。

1.2.3 標本采集用手術刀割取所研究大鼠脫毛部位中間組織，大小為1cm×1cm，保存在-50℃的冰箱中。使用前一天取出，在5℃的環(huán)境中冰浴3min 后，用離心機以2500r/min 的轉速分離，取上清液，保存至-50℃的冰箱中。

1.2.4 ELISA 法檢測IL-6、IL-32 表達采用酶聯免疫吸附試驗法，將待測的標本和酶標物嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行，將待測標本和固相載體放置在一起產生反應作用，將固相載體反應后產生的復合物經過洗滌與其他物質分離，最后加入酶反應底物，經過酶的催化作用形成有色物質，根據顏色的深淺進行定量分析標本中IL-6、IL-32 表達水平。

1.2.5 免疫透射比濁法檢測TGF-β、TNF-α表達

將待測標本放入特定蛋白分析儀中抗原抗體結合，形成復合物，經過一定時間反應觀察濁度。光線經過混合溶液時會被免疫復合物吸收。復合物量越多，吸收光線越多，利用比濁計測定光的密度值，分析TGF-β、TNF-α表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料采用均數±標準差描述，兩組間比較采用配對t 檢驗，P 值＜0.05 為具有統(tǒng)計學意義的標準。采用SAS9.4 軟件對單獨檢測和聯合檢測的特異度、敏感度和準確度進行計算分析。

2 結果

2.1 兩組大鼠小腸粘膜厚度、絨毛高度和上皮損傷的比較如表1 所示，模型組大鼠小腸粘膜厚度顯著低于正常組，絨毛厚度顯著低于正常組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組上皮損傷指數顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表1 兩組大鼠小腸粘膜厚度、絨毛高度和上皮損傷的比較

2.2 兩組大鼠IL-6、IL-32 表達比較如表2 所示，模型組大鼠IL-6 表達顯著高于正常組，IL-32 表達顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠IL-6、IL-32表達比較

2.3 兩組大鼠TGF-β、TNF-α表達比較如表3 所示，模型組大鼠TGF-β表達顯著高于正常組，TNF-α表達顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

2.4 IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α聯合檢測的意義

如表4 所示，IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α敏感度、特異度、準確度存在差異，TNF-α單獨檢測敏感度顯著高于其他三項，TGF-β單獨檢測特異度顯著高于其他三項，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α四項聯合檢測敏感度、特異度、準確度顯著高于單項檢測，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 兩組大鼠TGF-β、TNF-α表達比較

表4 IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α聯合檢測的意義

3 討論

急性胰腺炎在臨床上是最常見的急腹癥，主要的特點是病情高危，且并發(fā)癥多，患者的預后較差。造成急性胰腺炎的主要原因有很多，其中病理和生理上的原因較為復雜，多種原因形成，具體的發(fā)病機制尚未明確［4］。但是通過炎癥介質發(fā)病的學說，越來越引起重視。胰腺是腺泡損傷后，會釋放出具有活性的胰酶以及激活的巨噬細胞，會促進中性粒細胞產生大量的具有炎性的物質，其物質會導致胰腺血管的通透性的增強以及微循環(huán)會出現障礙，最終導致胰腺炎癥的發(fā)生嚴重時會導致胰腺壞死［5-6］。要想抓住急性胰腺炎最佳是治療時機，應該做到急性胰腺炎的早期診斷和對胰腺炎嚴重程度進行正確的評估，才能根據這些制定最佳的治療方案，同時對患者預防并發(fā)癥的發(fā)生、器官出現衰竭方面，具有重要的意義，及對患者預后生活質量的改善提高等方面也起到一定的積極作用［7］。

腸道是主要的消化吸收的器官，也是作為急性應激反應的重要器官，也是多功能器官出現衰竭的初始器官。當腸道中的腸粘膜通透性提高時，細菌和內毒素等會通過腸粘膜進入到其他組織，造成腸源的感染，嚴重會導致敗血癥或者急性前腦缺血致多器官功能障礙綜合征［8］。高通透的腸粘膜屏障，會使腸道細菌和內毒素發(fā)生易位，和急性胰腺炎的胰腺壞死引發(fā)的細菌感染有緊密的聯系，也是急性胰腺炎高死亡率的原因［9］。本文研究結果顯示，模型組大鼠小腸粘膜厚度顯著低于正常組，絨毛厚度顯著低于正常組，模型組上皮損傷指數顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異。急性胰腺炎患者主要的臨床表現是腸道黏膜出現缺損、缺氧，造成了腸粘膜的上皮損傷，導致腸通透性的提高。所以說，治療急性胰腺炎的重中之重是維護腸道黏膜的結構和功能，同時也是醫(yī)學界的主要研究內容。

白介素-6 是一種多肽，由纖維母細胞、單核細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、上皮細胞、膠質細胞以及多種腫瘤細胞分泌產生，刺激免疫細胞的分化增殖并提高其功能［10］。白介素-32（IL-32）屬于促炎細胞因子，可以在機體內誘導樹突狀細胞的分化增殖，并使樹突狀細胞分泌大量的TNF-α、IL-6 等炎癥因子，從而增強Th1、Th17 的應答反應，最終導致炎癥反應的加重，造成組織的損壞，在炎癥級臉反應中有重要意義［11］。本文數據顯示，模型組大鼠IL-6 表達顯著高于正常組，IL-32 表達顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異。說明，IL-6、IL-32 與急性胰腺炎有密切的聯系。在健康人體的胰腺組織中含有少量的IL-32，當人體發(fā)生嚴重的炎癥反應或者胰腺發(fā)生病變時，胰腺導管中的IL-32 水平會顯著上升。轉化生長因子-β（TGF-β）對于小膠質細胞的發(fā)育和穩(wěn)定具有促進作用，能夠調節(jié)膠質細胞的表型，對于神經元具有延緩死亡的作用［12-13］。TNF-α是一種具有炎性的細胞因子，主要是由巨噬細胞產生，當體內的TNF-α水平過高時，會引起炎性反應，造成器官的損傷［14］。TNF-α因子作為一種炎性因子，是重癥急性胰腺炎的始動因子，導致胰腺炎以及胰腺外組織器官損傷［15］。在重癥急性胰腺炎中，TNF-α水平顯著升高，與胰腺炎是損傷和炎癥的程度有密切關系在早期進行胰腺炎評估過程中具有重要的參考價值。在本文中，模型組大鼠TGF-β表達顯著高于正常組，TNF-α表達顯著高于正常組，具有統(tǒng)計學差異。說明，急性胰腺炎的發(fā)病與TGF-β、TNF-α有關。IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α敏感度、特異度、準確度存在差異，四項聯合檢測敏感度、特異度、準確度顯著高于單項檢測，具有統(tǒng)計學意義。說明，四項聯合檢測可以有效提升診斷效能，同時IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α水平也反映了機體的炎性狀態(tài)。

綜上所述，綜上所述，白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的高表達能夠在急性胰腺炎的診斷中起到非常重要的輔助引導作用，且這四項指標聯合檢測的敏感度、特異度、準確度較高，能夠提升診斷效能，對急性胰腺炎的治療與預后提供重要的參考價值。