延胡索HPLC 法有效成分檢測及其不同炮制法研究

杜金茗

（四川省骨科醫(yī)院，成都 610041）

延胡索屬于罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W. T. Wang）的干燥塊莖，是一種化瘀活血的中藥，其味辛、苦，性溫，主要應(yīng)用于胸痹心痛、產(chǎn)后瘀阻、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲腫痛等癥狀［1］。延胡索主要化學(xué)成分為甾體、酚酸、三萜類化合物、生物堿［2］，且近年來隨著現(xiàn)代藥理學(xué)對其不斷研究發(fā)現(xiàn)，其成分中生物堿活性成分在臨床已經(jīng)逐漸得到明確認(rèn)識，廣泛應(yīng)用于治療冠心?。?～4］。此外，延胡索還具有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等作用，同時具有較高的安全性［5～6］。臨床治療中多使用其炮制品，炮制方法主要有酒炙、醋炙等，有研究發(fā)現(xiàn)，酒炙延胡索可有效增強其化瘀活血的功效，而醋炙則能止痛療效、提高行氣［7～8］。但關(guān)于不同炮制方法對其有效成分含量影響的報道和研究卻鮮少。因此，本研究應(yīng)用HPLC 法對其延胡索乙素、甲素以及脫氫延胡索堿等主要生物堿成分進行檢測，并以延胡索乙素、去氫紫堇堿為參考指標(biāo)，探討不同炮制方法對其含量的影響，以期為提高延胡索藥材質(zhì)量和優(yōu)化其炮制工藝提供一定的參考依據(jù)。現(xiàn)進行如下報道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器應(yīng)用美國安捷倫公司生產(chǎn)型號為1260 的高效液相色譜儀；北京賽多利斯生產(chǎn)型號為BS-210S天平（精密度為0.0001g）；北京實驗儀器公司生產(chǎn)CO2真空干燥箱；上海生物科技有限公司生產(chǎn)超聲提取儀。

1.2 試藥延胡索生品藥材均購于胡慶余堂；延胡索乙素對照品（批號：110726）購于中國藥品生物制品檢定所；延胡索甲素對照品（純度：98.8%）和脫氫延胡索堿對照品（純度：99%）均為自制；黃酒選擇即墨黃酒，陳醋為山西老陳醋；水選擇三蒸水；甲醇、乙腈溶液為色譜純。

1.3 色譜條件有效成分檢測：流動相A 為乙腈，流動相B 為0.2%磷酸溶液，洗脫梯度和檢測波長（見表1）；色譜柱為Agilent XDB C18（250×4.6mm，5μm）；30℃柱溫；每分鐘1.0mL 流速，進樣量20μL；不同炮制法檢測：流動相為0.1%磷酸溶液：乙腈（28：72），色譜柱為Agilen C18，檢測波長為282nm，室溫為柱溫，每分鐘1.0mL 流速，進樣量10μL。

表1 流動相洗脫梯度和檢測波長

1.4 延胡索不同炮制方法酒炙延胡索：延胡索生品適量，應(yīng)用20%黃酒進行浸潤，待藥材完全吸盡酒液后，文火將藥材炒干。醋炙延胡索：延胡索生品適量，應(yīng)用40%陳醋進行浸潤，待藥材完全吸盡醋液后，文火將藥材炒干。醋煮延胡索：延胡索生品適量，應(yīng)用40%陳醋進行浸潤，待藥材完全吸盡醋液后，應(yīng)用武火將藥材藥液煮沸，文火蒸煮藥液，藥材將醋液完全吸收后置于CO2真空干燥箱中干燥。醋烘延胡索：延胡索生品適量，應(yīng)用40%陳醋進行浸潤，待藥材完全吸盡醋液后，置于CO2真空干燥箱中烘烤40min，溫度設(shè)置為120℃，之后取出室溫下晾干。

1.5 對照品溶液制備有效成分檢測：精密稱取12.5mg 延胡索乙素對照品、8.0mg 延胡索甲素對照品、6.5mg 脫氫延胡索堿，全部放置入25mL 量瓶并加入甲醇進行溶解，定容后過濾。精密稱取去氫紫堇堿、延胡索乙素適量，全部放置入10mL 容量瓶并加入甲醇進行溶解至定容刻度。

1.6 供試品溶液制備有效成分檢測：精密稱取后應(yīng)用粉碎機打成粉篩過后放置入平底燒杯中，按照甲醇和濃氨試液以20：1 的比例混合溶液50mL，稱定重量，1h 冷浸后1h 加熱回流，放冷后稱定重量，不足重量應(yīng)用甲醇和濃氨試液以20：1 的比例混合溶液進行補足，搖勻后濾過。精密稱取25mL 續(xù)濾液，蒸干后將甲醇加入濾渣進行溶解，更換至5mL 量瓶，稀釋至刻度，搖勻后濾過。不同炮制法檢測：精密稱取后應(yīng)用粉碎機打成粉篩過后放置入三角錐形瓶中，應(yīng)用150mL 水溶液進行定量，超聲半小時，之后室溫靜置過濾上層溶液，重復(fù)操作2 次，并蒸干超聲后濾液，將50mL 水 溶液加入殘渣進行溶解，之后加入10mL 濃氨水，連續(xù)萃取3次，萃取劑為乙醚溶液，每次30mL，并將3 次萃取液置于燒杯中進行水浴鍋蒸干，精密稱定蒸干后濃縮品，應(yīng)用甲醇溶液溶解至定容刻度。

1.7 測定法有效成分檢測：精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀進行測定，其代表色譜圖見圖1、2。

圖1 混合對照品（A）HPLC色譜圖（1：脫氫延胡索堿；2：延胡索甲素；3：延胡索乙素）

2 結(jié)果

圖2 延胡索樣品（B）HPLC色譜圖（1：脫氫延胡索堿；2：延胡索甲素；3：延胡索乙素）

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線有效成分檢測：分別精密稱取1、2、3、4、5mL 混合對照品溶液置入5mL 量瓶中，應(yīng)用甲醇定容后，吸取各溶液20μL，注入液相色譜儀測定峰面積，橫坐標(biāo)為對照品濃度，縱坐標(biāo)為峰面積。其中YY 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=21498X-309，r2=0.9999；YJ 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=22323X-516，r2=1.0000；TJ 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=20167X-512，r2=0.9996，結(jié)果表明，YY 在100μg/mL～500μg/mL、YJ 在64μg/mL～320μg/mL、TJ 在52μg/mL～260μg/mL 范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。不同炮制法檢測：分別精密稱取0.19、0.28、0.37、0.46、0.55mL 混合對照品溶液置入2mL 量瓶中，應(yīng)用甲醇定容后，吸取各溶液10μL，注入液相色譜儀分析。以延胡索含量與色譜峰面積對應(yīng)進行回歸分析，回歸方程Y=2.412×105X-6.14×104，γ=0.995，線性范圍為0.19～1.36μg，呈現(xiàn)相關(guān)性。

2.2 穩(wěn)定性有效成分檢測：按照2.3 和2.4 的方法進行相關(guān)溶液制備，并于制備后0h、2h、4h、6h、8h、24h 以后進行分析，觀察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果顯示24h 內(nèi)，YY、TJ 和YJ 對照品的RSD 為1.56%、1.97%和1.33%，而供試品的RSD 為0.87%、1.45%和1.56%，說明兩者在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。不同炮制法檢測：取同一供品溶液，于0h、2h、4h、6h、8h、10h 分析測定延胡索乙素含量，其RSD 為1.88%，說明供試品溶液在10h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3 儀器精密度有效成分檢測：連續(xù)精密稱取混合對照品溶液6 次，每次20μL。結(jié)果YY、TJ 和YJ 對照品的RSD 為0.46%、1.10%和0.79%，說明儀器精密度良好。不同炮制法檢測：連續(xù)精密稱取混合對照品溶液5次，每次10μL。結(jié)果回歸方程的RSD 為0.18%，說明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性有效成分檢測：取樣品粉末6 份，按照2.4 制備供試品溶液后進樣測定，結(jié)果YY、TJ 和YJ的含量分別為0.13%、0.07%和0.08%，RSD 分別為1.38%、1.91%和1.75%，說明檢測方法重復(fù)性良好。不同炮制法檢測：取同一批號樣品5 份，按照2.4 制備供試品溶液后進樣測定，結(jié)果RSD 為1.74%，說明檢測方法重復(fù)性良好。

2.5 回收率試驗有效成分檢測：取一定量樣品，并加入一定量對照品，按照2.3 制備樣品溶液進行測定，回收結(jié)果見表2。不同炮制法檢測：取一定量樣品，并加入一定量對照品，按照2.3 制備樣品溶液進行測定，回收結(jié)果見表3。

表2 脫氫延胡索堿、延胡索甲素及延胡索乙素加樣回收率計算結(jié)果

表3 延胡索乙素加樣回收率計算結(jié)果

2.6 樣品含量測定有效成分檢測：取延胡索藥材6批，按照2.4 制備供試品溶液并進行檢測，樣品含量檢測結(jié)果見表4。不同炮制法檢測：分別取生品、酒炙、醋炙、醋煮、醋烘延胡索，按照2.4 制備供試品溶液并檢測其延胡索乙素含量，樣品含量檢測結(jié)果見表5。

表4 延胡索藥材有效成分含量檢測結(jié)果

3 討論

HPLC 法是目前定量和分離植物中生物堿類成分最有有效的一種方法［9～10］。施菁［11］等通過色譜柱Symmetry C18的使用，流動相A 為乙腈，流動相B 為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長282nm，建立了在白花土元胡藥材中檢測延胡索甲素、乙素含量的方法。而陳峰陽［12］等則通過Diamonsil C18的使用，乙腈-0.2%醋酸（18：82）的流動相，檢測波長為340nm，流速為每分鐘1mL，建立了元胡藥材中檢測脫氫延胡索堿含量的方法。本研究在兩者基礎(chǔ)上同同時對延胡索中延胡索乙素、甲素和脫氫延胡索堿含量進行檢測，該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確、靈敏，可用于延胡索藥材質(zhì)量控制。

表5 不同供試品中延胡索乙素含量檢測結(jié)果

中藥延胡索因其散瘀、活血、止痛、理氣等功效且用藥安全在臨床應(yīng)用較為普遍，但多數(shù)均以炮制品的形式應(yīng)用于臨床。近年來，隨著不同延胡索炮制品在臨床應(yīng)用中各功效較生品延胡索顯著增強，不同炮制方法對其有效成分含量的影響逐漸成為醫(yī)學(xué)研究的熱點和重點。有研究結(jié)果顯示，延胡索的炮制方法主要有酒炙、醋炙、醋煮、醋烘等，且酒炙和醋炙兩種方法可使得延胡索中延胡索乙素的含量顯著升高［13］。本研究中，同樣通過酒炙、醋炙、醋煮和醋烘等方法制作延胡索炮制品，并對各炮制品中延胡索乙素的含量進行檢測，證實酒炙、醋炙和醋烘方法所得延胡索中延胡索乙素較延胡索生品中延胡索乙素明顯更高，這可能與延胡索中生物堿成分大多為游離態(tài)形式有關(guān)，因其難深于水，經(jīng)過酒炙和醋炙可增加生物堿鹽，從而增加溶解度。相關(guān)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)醋炙所得延胡索的延胡索乙素檢出率較生品延胡索高出約20%［14］。而醋煮所得延胡索中延胡索乙素較延胡索生品中延胡索乙素明顯更低，究其原因可能是因為蒸煮時間過長，導(dǎo)致延胡索中生物堿結(jié)構(gòu)遭到破壞。

延胡索經(jīng)傳統(tǒng)的酒炙、醋炙、醋烘后，其組織結(jié)構(gòu)得到一定改變，可幫助其有效成分的溶解、沁潤、轉(zhuǎn)化和擴散，從而提高延胡索乙素的融出率［15］。延胡索中有效成分的增加使得其藥效在疾病治療過程中相應(yīng)得到增強，進一步證實延胡索在經(jīng)酒炙、醋炙、醋烘等方法炮制后臨床治療效果的有效性。

綜上所述，HPLC 法用于檢測延胡索中有效成分可靠、準(zhǔn)確，也是評價其質(zhì)量的可靠依據(jù)，并能在此基礎(chǔ)上進行其指紋圖譜的研究，且通過超聲提取方法提取各延胡索炮制品，操作方式簡便，另HPLC 法用于檢測延胡索乙素時重復(fù)性好、精密度高，采用酒炙、醋炙、醋烘等炮制法可有效增加延胡索有效成分含量。