醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)對腦缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響

沈 婷，袁 婕，常 莎，馬 妮

（1. 西安工程大學(xué)校醫(yī)院內(nèi)科，西安 710048；2. 陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，西安 710068）

缺血再灌注損傷［1］是指當機體組織或者細胞缺血一段時間后.重新恢復(fù)供血，但當恢復(fù)供血后其因缺血導(dǎo)致的損傷不僅沒有得到緩解反而加重的癥狀。一般情況組織缺血后再灌注其功能后人結(jié)構(gòu)也會得到恢復(fù)。但是在腦組織中，缺血再灌注是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，不僅灌注后不會恢復(fù)其功能還會使得損傷加重［2］。腦部的缺血再灌注可能涉及到炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡［3］。醒腦靜是一種常見的急救藥。醒腦靜注射液是由安宮牛黃丸經(jīng)科學(xué)提取精制而成的水溶性靜脈注射液［4］。主要成分包括梔子、冰片、麝香等主要功效包括：開竅醒腦、清熱解毒。有研究表明［5，6］：醒腦靜注射液可以抑制神經(jīng)元的興奮性，并增加血腦屏障的通透性?？梢杂行У木徑饽X部的缺血再灌注損傷。本文旨在研究解醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)對腦缺血再灌注的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物雌性大鼠（SPF 級；6 周齡）30 只，由自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2017-0022。

1.2 藥物與試劑醒腦靜注射液 國藥準字 Z41020664；產(chǎn)品批號：20170821 購于廠家為河南天地藥業(yè)股份有限公司；Bcl-2、Bax 蛋白單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 儀器恒溫水箱購自上海信帆生物科技有限公司，SG-51 正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；721 分光光度計購自美國sigma 公司；LD-66 實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.4 模型建立［7］將大鼠麻醉，在大鼠頸總動脈距離頸內(nèi)動脈分叉處約5mm 處造口插入尼龍絲，使得大鼠腦中動脈閉塞2 小時，取出拔出栓線，恢復(fù)大鼠腦組織供血，制成大鼠腦缺血再灌注模型。

1.5 分組及缺血預(yù)適干預(yù)將造模的30 只大鼠為三組：模型組、醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適組，選取醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適組，從第5 周開始缺血預(yù)適應(yīng)，缺血預(yù)適應(yīng)方法為：結(jié)扎大鼠5min 缺血，5 min 再灌反復(fù)循環(huán)3 次，一次/d。注射藥物：A 組（空白組）：生理鹽水 15mL/kg，B 組（模型組）生理鹽水 15mL/kg，C 組（醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適組）醒腦靜注射液 15mL/kg。

1.6 檢測項目

1.6.1 缺血側(cè)腦組織形態(tài)學(xué)變化常規(guī)使用HE 染色后使用中性樹膠封片。400 倍光鏡觀察腦組織凋亡情況。

1.6.2 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)對細胞凋亡影響使用TUNEL 染色，具體步驟為：使用二甲苯脫蠟浸泡10 min再梯度酒精脫蠟，完成后用PBS 沖洗 5min 后使用蒸餾水清洗 2 min，重復(fù)清洗多次后使用2 %過氧化氫的PBS 溶液浸泡5 min。使用PBS 緩沖液沖洗5 min 后使用TdT 酶反應(yīng)液浸泡1 h。使用PBS 緩沖液沖洗多次后使用過氧化物酶標記的抗地高辛抗體處理30 min 后PBS 洗5 min，使用DAB 顯色 5 min 后使用蒸餾水清洗多次。使用中性樹膠封片。400 倍光鏡觀察12h、24h、36h 細胞凋亡數(shù)目并計算凋亡率。

1.6.3 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)大鼠Bcl-2、Bax 蛋白表達影響使用Western blot 檢測大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況，取大鼠腦組織，使用胰蛋白酶消化后，使用BCA 法測定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE 電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后放入 TBST溶液中緩慢搖動洗膜5 分鐘，再將 PVDF 膜放入配制好的一抗液中孵育，室溫下緩慢搖動 30 分鐘后放入4℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST 洗滌三遍后放入二抗反應(yīng)液中室溫孵育 2 小時；封閉液：二抗為2000：1；曝光后以β-actin 為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法本研究采用SPSS 18.0 軟件和Excel2010 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，方差分析使用單因素方差分析，所有檢驗中P＜0.05 即提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 缺血側(cè)腦組織形態(tài)學(xué)變化空白對照組大鼠腦組織細胞數(shù)目較多，細胞輪廓清晰、緊密。模型組大鼠的腦組織細胞間質(zhì)水腫且結(jié)構(gòu)變得疏松，個數(shù)也顯著減少。相比模型組，醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組大鼠的細胞較多，輪廓較為清晰、緊密，細胞間質(zhì)水腫明顯減少，見圖1。

圖1 缺血側(cè)腦組織形態(tài)學(xué)變化（×400）

2.2 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)對細胞凋亡影響與空白組相比，模型組大鼠12 h 時，細胞凋亡百分比上升（P＜0.01）；24 h 時，細胞凋亡百分比上升（P＜0.01）；36 h 細胞凋亡百分比上升（P＜0.01）。與空白組相比，實驗組大鼠12 h 時，細胞凋亡百分比上升（P＜0.05）；24 h 細胞凋亡百分比上升（P＜0.05）；36 h 細胞凋亡百分比上升（P＜0.05）。與模型組相比，實驗組大鼠12 h 時，細胞凋亡百分比下降（P＜0.01）；24 h 細胞凋亡百分比下降（P＜0.01）；36 h 細胞凋亡百分比下降（P＜0.01），見圖2。

2.3 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)大鼠Bcl-2、Bax 蛋白表達影響與空白組相比，模型組大鼠Bcl-2 蛋白的表達下降（P＜0.01），模型組大鼠Bax 蛋白表達升高（P＜0.01）。與空白組相比，醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組大鼠Bcl-2 蛋白的表達升高（P＜0.01），醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組大鼠Bax 蛋白表達下降（P＜0.01）。與模型組相比，醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組Bcl-2 蛋白的表達升高（P＜0.01），Bax蛋白表達下降（P＜0.01），見圖3。

由圖4 可知，相比空白組，模型組大鼠的Bcl-2 蛋白表達顯著下降，相比模型組腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組大鼠的Bcl-2 蛋白表達有一定的增加。

圖2 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)對細胞凋亡影響

圖3 醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達影響

2.4 大鼠腦組織的Bcl-2、Bax 蛋白觀察由圖5 可知，相比空白組，模型組大鼠的Bax 蛋白表達顯著升高，相比模型組腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組大鼠的Bax 蛋白表達有一定的減少。

3 討論

細胞凋亡（Apoptosis）是由Kerr 等提出的一種在形態(tài)學(xué)上和壞死完全不同的細胞死亡類型［8］。Steller 和GE 研究表明：在腦缺血后細胞受到影響會自行按照界定的程序死亡的［9，10］。本實驗中，使用醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)方法的大鼠腦組織程序性死亡的數(shù)量顯著低于模型組，說明了使用醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)方法有效保護了大鼠的腦組織細胞，達到了緩解了腦組織的凋亡的效果。

圖4 大鼠腦組織的Bcl-2蛋白表達觀察

圖5 大鼠腦組織的Bcl-2蛋白表達觀察

目前研究發(fā)現(xiàn)：Bcl-2 是Bcl-2 家族調(diào)控細胞凋亡的蛋白，Bcl-2 可以抑制細胞的凋亡，Bcl-2 家族的Bax蛋白可以促進細胞的凋亡［11］也有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 的高表達能夠使缺血性腦損傷得到有效的緩解［12，13］，緩解缺血性腦損傷的主要作用是抑制細胞凋亡，Bcl-2 也是神經(jīng)系統(tǒng)的主要保護性蛋白，其表達量越高，對腦部的保護作用越強［14］，Bax 蛋白作為抑制凋亡的蛋白，其表達越高，腦損傷越重。因此，檢驗Bcl-2 和Bax 的表達水平可有效的反映腦部損傷的程度。本實驗顯示，醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組的大鼠的Bcl-2 蛋白的表達上升，Bax 蛋白表達下降，可以看出使用醒腦靜聯(lián)合缺血法可以顯著抑制大鼠腦細胞的凋亡，達到保護大鼠腦組織的作用，從而有效緩解缺血性腦損傷，Wang 等研究［15］得出：上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達、下調(diào)Bax 蛋白的表達可以有效緩解缺血再灌注損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

可見，醒腦靜聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)法可以有效的緩解腦缺血再灌注損傷，其機制可能與通過下調(diào)Bax 蛋白和上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達有關(guān)，在后續(xù)的實驗將進一步擴大樣本量進行實驗。