運(yùn)動誘導(dǎo)的生理性心肌肥大中miR-497-3p的表達(dá)變化及作用

張波 齊潔 張鈞

1 濮陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（河南濮陽457000）

2 上海師范大學(xué)體育學(xué)院（上海200234）

研究認(rèn)為[1]心肌肥大是心臟重塑的主要表現(xiàn)之一，并且將心臟重塑分為生理性重塑和病理性重塑。運(yùn)動性心臟肥大是一種典型的生理性心臟肥大。microRNAs 是生物體內(nèi)的一組具有高度保守性的非編碼RNA，由20～30個(gè)核苷酸組成，長度為19～25個(gè)堿基，它們主要通過與靶基因3’端結(jié)合抑制靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[2-3]，其在運(yùn)動性心肌肥大中起著重要作用[4]，相關(guān)研究指出過表達(dá)miR-130b、miR-653、miR-103-1 等或抑制miR-126、miR-181a 等均可形成生理性心臟肥大[5-8]。細(xì)胞自噬是一種普遍存在的代謝方式，可降解心肌細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器等來調(diào)節(jié)運(yùn)動性心肌肥大。亦有文獻(xiàn)指出，miRNAs可通過調(diào)節(jié)不同自噬相關(guān)基因調(diào)節(jié)自噬活性，如miR-181a 可調(diào)節(jié)Atg-5[9]，miR-16 可調(diào)節(jié)Atg-14[10]等。有研究指出在運(yùn)動性心肌肥大中，miR-497-3p發(fā)生顯著下調(diào)[5]；李麗等[11]發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動可上調(diào)心肌細(xì)胞自噬的作用。但miR-497-3p是否可通過Beclin1影響自噬水平，進(jìn)而參與運(yùn)動性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展仍不明確。本研究通過檢測miR-497-3p 及其下游Beclin1在運(yùn)動性心肌肥大組織中的表達(dá)，探討其在運(yùn)動性心肌肥大形成過程中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡Sprague-Dawley純系雄性健康大鼠24只，體重130 ± 20 g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證編號：SCXK（滬）2012-0002。分籠喂養(yǎng)，每籠4 ±1只。室溫22 ± 3℃，相對濕度45%～55%，自然光照，自由攝食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠心肌肥大模型的制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組：安靜對照組（n=12）、運(yùn)動性心肌肥大模型組（n=12）。參照Fernandes 和Hashimoto 等[12]的研究制定10 周游泳運(yùn)動訓(xùn)練方案。運(yùn)動結(jié)束后通過檢測大鼠體重、心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)，并進(jìn)行HE 染色，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測大鼠心肌病理性肥大相關(guān)標(biāo)志物基因心鈉素（atrial natriuretic polypeptide，ANP）、心肌肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain）α 和β（α-MHC、β-MHC）、α-肌動蛋白（α-actin）、肌漿網(wǎng)鈣ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase ，SERCA2α）的表達(dá)，綜合評價(jià)運(yùn)動性心肌肥大動物模型的建立。

1.3 取材

運(yùn)動組大鼠于末次游泳運(yùn)動后，與對照組大鼠一起禁食12 小時(shí)。次日用10%水合氯醛按50 mg/kg 體重腹腔麻醉后，取大鼠心臟稱重，切取左心室壁，計(jì)算全心指數(shù)及左心室指數(shù)（全心指數(shù)=全心重量/體重，左心室指數(shù)=左心室重量/體重）；經(jīng)多聚甲醛固定后用于制作石蠟切片。組織經(jīng)石蠟包埋后，于切片機(jī)切取5 μm 厚的石蠟切片，將切片粘在干凈的載玻片上，進(jìn)行HE染色。用光學(xué)顯微鏡放大400倍觀察處理好的載玻片并拍照，并用Image-Pro Plus6.0軟件測量細(xì)胞直徑，多次測量取平均值。其余組織迅速裝入標(biāo)記好的凍存管中，投進(jìn)液氮，然后轉(zhuǎn)入－80℃保存，用于mRNA 及蛋白檢測。

1.4 RNA提取與RT-qPCR

嚴(yán)格按照Trizol 法進(jìn)行組織總RNA 提取，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行定量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，首先通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）：miR-497-3p采用加尾反轉(zhuǎn)錄，將樣品RNA 濃度稀釋為2ng/μl，按照Mir-XTMmiRNAFrist-Strand Synthesis and SYBR?RT-qPCR UserManual 試劑盒（TaKaRa 公司）的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作（10 μl 體系）；Beclin1 反轉(zhuǎn)錄：將樣品RNA 的濃度稀釋為100 ng/μl，按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa 公司）的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。然后用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增出互補(bǔ)的脫氧核糖核酸（cDNA）：實(shí)驗(yàn)步驟按SYBR?Premix Ex TaqTMII（TilRNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa 公司）說明書進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)熒光定量檢測采用2-△△Ct法，內(nèi)參為GAPDH。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

在NCBI的Nucleotide 數(shù)據(jù)庫中尋找目標(biāo)mRNA的核酸序列，使用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物，通過Blast軟件對引物的特異性進(jìn)行匹配，最后使用Oligo7.37篩選最優(yōu)化的引物，具體引物結(jié)構(gòu)參考表1。

表1 引物序列

1.5 總蛋白提取及Western Blotting

從心肌組織和心肌細(xì)胞中提取總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒（23227，ThermoScientific，Rockford，Illinois，USA）按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行定量。蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，一抗GAPDH、Beclin1（1∶1000，Cell Signaling Technology公司）4℃孵育過夜，次日洗膜、孵育二抗（1∶1000，CellSignaling Technology 公司），洗膜然后進(jìn)行顯色分析。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過生物信息學(xué)在線軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org）、Pic Tar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）及DIANAmicroT（http：//www.microrna.gr/microT）預(yù)測miR-497-3p 的靶基因，GenBank 中查找miR-497-3p 靶基因Beclin1 3'UTR 序列，分別構(gòu)建兩端帶有Not Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的含有野生型Beclin1 3’-UTR 序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（Beclin1-WT）和含有突變型Beclin1 3’-UTR 序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（Beclin1-Mut）。之后重組入雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psi-CHECK2多克隆位點(diǎn)，分別獲得野生型及突變型克隆并測序鑒定正確性。

構(gòu)建成功后與miR-497-3p mimics、mimics-NC、miR-497-3p inhibitors、inhibitor-NC 共轉(zhuǎn)染到H9C2 細(xì)胞中，H9C2 細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基加10%胎牛血清、1%雙抗，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按3×105個(gè)/ml 的密度接種細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，用Promega Dual LuciferaseAssayKit 處理，用GloMaxTM96 Microplate Luminometer測定熒光活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性t檢驗(yàn)，采用LSD 法進(jìn)行多重比較，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動性心肌肥大動物模型的建立

2.1.1 大鼠全心指數(shù)、左室指數(shù)的變化

如表2 和圖1 所示，10 周游泳運(yùn)動后，模型組大鼠全心指數(shù)、左室指數(shù)及心肌細(xì)胞直徑均高于對照組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。以上結(jié)果表明：10 周游泳運(yùn)動刺激使大鼠心臟左心室肥大。

表2 大鼠心臟肥大狀況評價(jià)

圖1 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)（HE染色）

2.1.2 大鼠心肌組織ANP、α-MHC、β-MHC、α-actin mRNA的表達(dá)變化

表3 顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌內(nèi)ANP、α-actin、α-MHC、β-MHC、SERCA2α的mRNA 表達(dá)水平并未發(fā)生顯著的變化。結(jié)合全心指數(shù)、左心室指數(shù)、心肌細(xì)胞直徑及病理性指標(biāo)結(jié)果可知：10周游泳運(yùn)動并未導(dǎo)致大鼠心臟病理性肥大，運(yùn)動性心臟肥大模型建立成功。

表3 心肌病理性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)量

2.2 大鼠心肌miR-497-3p的表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：運(yùn)動10周后運(yùn)動性心肌肥大模型組（0.77 ± 0.13）大鼠心肌組織miR-497-3p 表達(dá)水平較對照組（1.00 ± 0.06）顯著降低（P＜0.01）。

2.3 大鼠心肌組織Beclin1 蛋白和mRNA 表達(dá)水平的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組（1.00 ± 0.24）相比，運(yùn)動性心肌肥大模型組（2.09 ± 0.72）大鼠心肌組織中Beclin1 mRNA 顯著上升（P＜0.01），蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖2）。

圖2 大鼠心肌Beclin1蛋白表達(dá)水平變化

2.4 過表達(dá)及干擾表達(dá)miR-497-3p腺病毒感染H9C2心肌細(xì)胞中Beclin1表達(dá)水平變化

如表4 及圖3 所示，與H9C2 空白細(xì)胞和對照病毒感染細(xì)胞組相比，miR-497-3p過表達(dá)腺病毒感染細(xì)胞后Beclin1 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.01），空白細(xì)胞無差異。表5及圖4表示：與對照病毒感染細(xì)胞相比，miR-497-3p干擾表達(dá)腺病毒感染細(xì)胞中Beclin1 mRNA 和蛋白的水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.01），空白細(xì)胞無差異。

表4 miR-497-3p過表達(dá)病毒感染心肌細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)水平變化

圖3 miR-497-3p過表達(dá)病毒感染心肌細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平變化

表5 miR-497-3p干擾表達(dá)腺病毒感染心肌細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)水平變化

2.5 miR-497-3p 靶向調(diào)控Beclin1調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大

如圖5所示，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明：共轉(zhuǎn)染野生型Beclin1（Beclin1-WT 3’UTR）和模擬過表達(dá)miR-497-3p（miR-497-3pmimics）組相對熒光素酶活性顯著低于mimics-NC組；與之相反，共轉(zhuǎn)染突變型Beclin1 （Beclin1-WT 3’UTR）和模擬抑制表達(dá)miR-497-3p（miR-497-3p inhibitor）組相對熒光素酶活性顯著高于inhibitor-NC 組，而兩組分別與Beclin1-MT 3’UTR共轉(zhuǎn)染后，與NC組無差異。

3 討論

3.1 運(yùn)動性心肌肥大動物模型的建立評價(jià)

運(yùn)動性心肌肥大是運(yùn)動訓(xùn)練中普遍出現(xiàn)的一種生理現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為心臟增大、重量增加、心肌肥大、體積增大、心室壁增厚等[13-15]。在運(yùn)動性心臟肥大中，運(yùn)動刺激激活心肌蛋白質(zhì)合成的信號通路，抑制代謝通路，導(dǎo)致心肌蛋白質(zhì)合成增多從而形成運(yùn)動性心肌肥大[16]。在病理性心肌肥大中，心肌纖維不僅變肥大，還會出現(xiàn)邊緣不整齊、縱橫交錯(cuò)，纖維間產(chǎn)生水腫、細(xì)胞核增大等現(xiàn)象[17]。在病理性心臟肥大中，ANP 和骨骼肌α-actin的表達(dá)量上升，同時(shí)心肌細(xì)胞中的α-MHC轉(zhuǎn)換為β-MHC，因此α-MHC/β-MHC 的比值降低[18]。本研究結(jié)果表明：10 周的游泳運(yùn)動導(dǎo)致模型組大鼠全心指數(shù)、左室指數(shù)及心肌細(xì)胞的直徑顯著增加，病理性心臟肥大相關(guān)指標(biāo)均未發(fā)生改變，提示SD大鼠運(yùn)動性心肌肥大模型建立成功。

圖4 miR-497-3p干擾表達(dá)腺病毒感染心肌細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平變化

圖5 野生型及突變型Beclin1在過表達(dá)、抑制表達(dá)miR-497-3p后的變化

3.2 miR-497-3p 負(fù)性調(diào)控Beclin1調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大

研究表明，miRNAs表達(dá)水平的變化與運(yùn)動性心肌肥大有關(guān)[13，19-21]。為了進(jìn)一步研究引起大鼠運(yùn)動性心肌肥大的機(jī)制，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究選擇了參與調(diào)控自噬相關(guān)基因的miRNAs 進(jìn)行研究。前述的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)明確在運(yùn)動性心肌肥大中miR-497-3p 表達(dá)下降。有研究發(fā)現(xiàn)：運(yùn)動主要通過控制心肌蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)而增加心肌細(xì)胞自噬水平，從而維持心肌細(xì)胞正常的能量代謝，保持正常心功能，調(diào)節(jié)心臟生理性肥大。為了探討在運(yùn)動性心肌肥大中自噬水平的變化，本研究檢測了大鼠心肌組織自噬標(biāo)記物——Beclin1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在運(yùn)動性心肌肥大模型組大鼠心肌中，自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)顯著上升。

既往也有文獻(xiàn)指出下調(diào)miR-497可使自噬活性增強(qiáng)[22]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-497-3p 是否通過自噬相關(guān)基因Beclin1調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大，本研究通過選取H9C2心肌細(xì)胞感染過表達(dá)及干擾表達(dá)miR-497-3p之后檢測Beclin1 mRNA和蛋白水平。本研究結(jié)果表明，H9C2 心肌細(xì)胞感染過表達(dá)miR-497-3p 腺病毒后，抑制了自噬相關(guān)基因Beclin1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平；感染干擾表達(dá)miR-497-3p 腺病毒后，Beclin1 mRNA和蛋白的水平顯著升高。通過miRNA 靶點(diǎn)的生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，大鼠Beclin1 的基因序列中，編碼區(qū)第1595-1601 堿基的位置序列（TGGTTTG）是miR-497-3p的結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證后，確定Beclin1 是miR-497-3p 的靶基因。綜上所述，在運(yùn)動性心肌肥大中，miR-497-3p可靶向負(fù)性調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)。

3.3 運(yùn)動通過影響miR-497-3p 調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大的機(jī)制探討

細(xì)胞自噬是生命體中普遍存在的一種代謝通路，是物種進(jìn)化過程中高度保守的代謝機(jī)制[23]。目前已發(fā)現(xiàn)30 余種自噬相關(guān)基因（autophagyrelatedgenes，Atg），這些蛋白質(zhì)調(diào)控了細(xì)胞自噬的起始、進(jìn)展、成熟及與溶酶體融合[24]。由Atg1、Atg13、Atg17、Atg9組成的泛素激酶（ubiquitin like kinase，ULK）復(fù)合物，與Beclin-1 結(jié)合的IP3復(fù)合物，Atg5-Atg12-Atg16多聚復(fù)合物參與自噬起始階段[25-26]。一旦自噬激活，Beclin1便從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Bcl-2/Beclin1 復(fù)合物中解離，與UVRAG（Ultra-Violet Radiation Resistance-Associated Gene）、AMBRA（Activating Molecule in Beclin1-Regulated Autophagy）形成復(fù)合物，然后再由Atg7 和Atg10 介導(dǎo)形成Atg5-Atg12-Atg10 多聚復(fù)合物。Beclin1 是自噬小泡形成的起始調(diào)節(jié)因子[27]，減少其表達(dá)則會干擾自噬的發(fā)生，所以Beclin1是自噬體成核的關(guān)鍵基因之一[28]。多種因素可調(diào)控細(xì)胞自噬，相關(guān)研究已明確指出雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可負(fù)性調(diào)控自噬水平[29]，又有研究指出心肌中的單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）活性可被有氧運(yùn)動上調(diào)[30]。這提示自噬可通過運(yùn)動訓(xùn)練這種機(jī)械刺激來調(diào)節(jié)[31]，進(jìn)而平衡運(yùn)動中、運(yùn)動后心肌細(xì)胞的能量代謝。

大量研究指出，自噬在運(yùn)動性心臟肥大產(chǎn)生中扮演著重要角色。一方面，自噬激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡[32-34]，亦有文獻(xiàn)提出抑制細(xì)胞凋亡是產(chǎn)生運(yùn)動性心肌肥大的重要途徑之一[35]。另一方面，心肌細(xì)胞自噬可通過自噬溶酶體途徑清除衰老或受損的細(xì)胞器、衰老或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、自由基等代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生游離脂肪酸和氨基酸等能源物質(zhì)，而后通過三羧酸循環(huán)生成ATP，供心肌細(xì)胞能量代謝需要[36，17]，這些物質(zhì)也是產(chǎn)生心臟肥大的原材料，促進(jìn)心肌增殖。在運(yùn)動刺激下，自噬還能夠通過清除心肌細(xì)胞衰老或受損的細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊的蛋白，有效預(yù)防心臟產(chǎn)生過度肥大，或抑制生理性肥大向病理性肥大的轉(zhuǎn)變，這在心肌對運(yùn)動的適應(yīng)中起著重要作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞中miRNAs可調(diào)控自噬水平[37-40]。本研究結(jié)果也表明，運(yùn)動通過下調(diào)miR-497-3p靶向促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白基因Beclin1的表達(dá)提高自噬水平，最終調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大的發(fā)生。

細(xì)胞自噬在保持心臟正常結(jié)構(gòu)與生理功能方面具有極其重要的作用。本研究結(jié)果顯示：運(yùn)動性心肌肥大模型組大鼠心肌組織中的miR-497-3p 表達(dá)顯著下調(diào)，Beclin1 作為miR-497-3p 的靶基因，其表達(dá)水平顯著升高。這表明10 周的運(yùn)動不僅促進(jìn)心臟生理性肥大形成，還誘導(dǎo)了自噬通路的激活。運(yùn)動不僅可以上調(diào)心肌細(xì)胞自噬水平，維持心肌細(xì)胞正常的能量代謝，也能調(diào)節(jié)心臟生理性肥大，保持正常的心功能。

4 結(jié)論

綜上，本研究通過靶基因預(yù)測、靶基因表達(dá)檢測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，Beclin1是miR-497-3p的靶基因；10周游泳運(yùn)動可下調(diào)大鼠心肌miR-497-3p的表達(dá)，靶向升高Beclin1 的表達(dá)引起自噬水平增強(qiáng)，從而調(diào)控運(yùn)動性心肌肥大的形成。