青蒿琥酯治療肺孢子菌肺炎的實驗研究①

黃 笛，吳健林，周冬生

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染性疾病科，廣西 桂林 541199)

近年來，伴隨著HIV 感染者不斷增加，抗腫瘤、放化療以及器官移植的廣泛開展以及其他原因所致先天或后天性免疫機能缺陷者的增多，肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。PCP的臨床病癥進展迅速，若未能及時治療，病死率幾乎達(dá)100%。目前，尚無一種抗PCP 的高效低毒藥物治療方案。即使及時應(yīng)用復(fù)方磺胺甲惡唑、糖皮質(zhì)激素等治療，其病死率亦超過30%，而且存在著一些問題，如藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重、抗藥性增加、治療后易復(fù)發(fā)或再感染等[2]。因此，研發(fā)更為有效的抗PCP或預(yù)防PCP藥物顯得尤為重要。青蒿琥酯有多方面的藥理作用，具有多靶點或廣譜化療的特色。筆者探討青蒿琥酯治療大鼠卡氏肺孢子菌肺炎模型，通過病原學(xué)及病理學(xué)改變觀察其療效，為卡氏肺孢子菌肺炎的治療提供的依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

無特殊病原級雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(140±25)g，購自桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，分籠飼養(yǎng)在濕度為40%、溫度為28 ℃左右的動物實驗室內(nèi)，自由進食、進水。PC包囊懸液購自億源醫(yī)療有限公司，槲皮素購自上海佳和生物科技有限公司，地塞米松磷酸鈉注射液和鹽酸四環(huán)素購自西南制藥廠。

1.2 方法

SD大鼠分4組，每組10只：A為免疫功能正常大鼠組；B為PC刺激免疫功能正常大鼠組；C為PCP模型組；D為青蒿琥酯治療組。C、D組2次/周，共6周，每次每只皮下注射地塞米松2.5 mg誘發(fā)建立肺孢子菌肺炎的動物模型，A、B注射同體積的生理鹽水，B、C、D組通過大鼠鼻腔滴入1×104CFU/ml 的液氮凍存復(fù)蘇的PC包囊懸液0.1 ml，D組加青蒿琥酯60 mg·kg-1·d-1進行干預(yù)。所有大鼠的飲水中加入1 g/L鹽酸四環(huán)素預(yù)防繼發(fā)性細(xì)菌性感染。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 肺組織病理 第8周末處死大鼠，先取大鼠肺組織行肺組織活檢，明確PC包囊的存在，再經(jīng)10%甲醛溶液固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚度約4 μm。切片常規(guī)HE染色，脫水、透明、封片。

1.3.2 GMS 染色檢測PC包囊 取實驗鼠肺組織做肺葉橫斷印片，環(huán)6亞甲基4胺銀(GMS)染色，每個印片隨機計數(shù)10 個油鏡視野的PC包囊數(shù)，判斷PC感染程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理變化

在觀察結(jié)束后處死大鼠，取大鼠肺組織制作大鼠肺組織冰凍切片行HE染色觀察肺組織的病理變化。A組大鼠肺組織均正常，肺泡空隙明顯，肺泡間質(zhì)未見充血、增寬，肺泡內(nèi)無滲出和炎性細(xì)胞浸潤，見圖1a。B組大鼠肺組織基本正常，肺泡空隙明顯，肺泡間質(zhì)少許充血、增寬，肺泡內(nèi)少許滲出和炎性細(xì)胞浸潤，見圖1b。C組大鼠均為重度間質(zhì)性肺炎，肉眼觀肺部大量充血，質(zhì)地較實，大量炎性細(xì)胞浸潤，見圖1c。D組大鼠肺泡壁充血較C組明顯減少，肺泡中大量的漿液性滲出物已基本上被吸收，肺泡間質(zhì)中炎性細(xì)胞減少，見圖1d。

圖1a

2.2 大鼠的肺孢子菌感染程度比較

A組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)PC包囊，見圖2a。B組偶見少許PC包囊，印片包囊均數(shù)(1.3±1.1)，見圖2b。C組大鼠的肺組織印片中PC感染率非常高，印片包囊均數(shù)(8.6±2.1)，見圖2c。D組感染卡氏肺孢子菌的程度較C組低，但較B組高，印片包囊均數(shù)(6.4±1.7)，見圖2d。C、D組包囊數(shù)高于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組包囊數(shù)低于C組(P<0.05)。

圖2a

3 討論

肺孢子菌肺炎是肺孢子菌(Pneumocystis，PC)引起的急性肺炎，是一種發(fā)生于免疫功能低下患者的嚴(yán)重肺部機會性感染。其在正常人體可以共生或以正常菌群的形式定植于人的呼吸道，在不同人群中肺孢子菌定植率也不同，在健康成年人定植率為0～20%，HIV患者中定植率為31%～68%[3]。當(dāng)人體免疫機能受損或免疫功能低下時引起致命的肺孢子菌肺炎。筆者的研究中，正常對照組(A組)和PC刺激對照組(B組)大鼠不管是在肺部損傷程度，還是肺組織印片中PC感染率都非常低，說明免疫功能正常的大鼠能有效抵御肺孢子菌的侵襲，再次證實了PC為一種致病性很弱的機會感染性真菌。

評價療效最直接有效的指標(biāo)是檢測肺內(nèi)的肺孢子菌負(fù)荷，經(jīng) GMS 染色觀察的肺印片中肺孢子菌包囊數(shù)是經(jīng)典有效的方法[4]。本實驗在行HE 染色觀察肺組織的病理變化前，先取各組大鼠肺組織行肺組織活檢，結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織中可見大量肺孢子菌的包囊或滋養(yǎng)體，證實大鼠肺組織損傷由PC感染引起，病理學(xué)觀察顯示模型組肺實變明顯，炎性細(xì)胞及炎性滲出物大量聚集于肺泡腔及肺泡間質(zhì)內(nèi)；青蒿琥酯治療組肺印片包囊數(shù)明顯減少，肺炎性損傷明顯改善，說明青蒿琥酯不僅有抗肺孢子菌作用，還大大減輕了卡氏肺孢子菌所引起的肺部結(jié)構(gòu)損傷。

青蒿琥酯是從菊科艾屬植物黃花蒿中分離出的一種有抗瘧作用的成分，青蒿琥酯作為臨床上有效的抗瘧新藥，自20世紀(jì)80年代研制成功以來，廣大學(xué)者對青蒿琥酯抗瘧之外的藥理作用及作用機制不斷地擴大和深入，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯有多方面的藥理作用，具有多靶點或廣譜化療的特色，具有抗瘧、抗腫瘤、抗弓形蟲、抗孕、平喘、對抗內(nèi)毒素血癥等作用[5-8]。研究還表明青蒿琥酯有抗肺孢子菌的作用，其通過破壞PC膜系結(jié)構(gòu)，引起PC包囊及滋養(yǎng)體胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、線粒體腫脹、核膜破裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、囊內(nèi)小體溶解破壞等超微結(jié)構(gòu)的改變[9]。

本研究顯示青蒿琥酯不僅有抗肺孢子菌作用，還減輕了卡氏肺孢子菌所引起的肺部結(jié)構(gòu)損傷。而且，青蒿琥酯具有相對安全的藥物特性[10]，這將為肺孢子菌肺炎的治療提供一條新的途徑和選擇。