山葡萄有機(jī)酸降解菌的篩選、分離及鑒定

吳曼毓，蔣海芹，賀陽，文連奎，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.唐山市市場監(jiān)督管理局，河北唐山063200）

山葡萄（Vitis amurensis Rupr）主要用于釀造山葡萄酒和加工山葡萄汁，其果實有機(jī)酸含量達(dá)質(zhì)量濃度10 g/L～28 g/L[1]，主要為酒石酸，少量蘋果酸和檸檬酸。因酸度較高，口感酸澀，易引起酒液失光、渾濁等現(xiàn)象[2-3]，因此，降低山葡萄酒酸度是提高感官品質(zhì)的關(guān)鍵。

目前，國內(nèi)外果酒降酸方法主要有化學(xué)降酸、物理降酸和生物降酸，其中化學(xué)降酸應(yīng)用較為廣泛但易使酒液中殘留礦物質(zhì)，影響果酒感官特性[4-5]；物理降酸效果甚微，且成本較高；因此，生物降酸成為果實降酸研究的熱點。楊華等從紅豆越橘汁中分離出菌株BY-9，接入發(fā)酵后的紅豆越橘果酒中，使總酸含量降低12.26%[6]。郝愛玲等篩選出降酸能力最強(qiáng)（降酸率18.12%）的東方伊薩酵母M130應(yīng)用于獼猴桃酒降酸[7]。文連奎等從含酒石酸的環(huán)境中分離得到黑曲霉F1，對酒石酸降解率高達(dá)70%[8]。王立芳等篩選出的陸生伊薩酵母對蘋果酸的降酸率達(dá)79.9%，對檸檬酸的降解率達(dá)73.1%[9]。Zeravik等利用乳酸菌，通過蘋果酸乳酸發(fā)酵降低了葡萄酒的酸度[10-12]。本試驗從山葡萄生長的土壤中篩選具有降酸作用的菌株，為山葡萄酒生物降酸研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)山葡萄園，鏟去地表5 cm左右浮土和植物根系，采集深度為10 cm～15 cm。

無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、酚酞指示劑（均為分析純）：北京化工廠；甘油（分析純）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；酒石酸、蘋果酸、檸檬酸（均為分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；瓊脂粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；YPD液體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜級）：美國TEDIA。

1.2 儀器與設(shè)備

大容量多孔離心機(jī)（LXJ-ⅡB）：上海安亭科學(xué)儀器廠；壓力蒸汽滅菌鍋（LS-3D）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）、振蕩培養(yǎng)箱（SPX-250B-D）：上海博迅實業(yè)有限公司；高效液相色譜（1200）：美國 Agilent；pH 計（pH-3C）：上海佑科儀器儀表有限公司；雙人凈化工作臺（SW-CJ-2D）：浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；生物顯微鏡（DM1000）：德國 LEICA；電泳儀（DYY-11）：北京市六一儀器廠；PCR儀 （2720）、DNA 測序儀（3730 XL）：美國 ABI。

1.3 方法

1.3.1 降酸菌株的篩選

取（2±0.2）g土壤裝入錐形瓶，加入100 mL無菌生理鹽水。錐形瓶中加入玻璃珠后放入搖床振蕩20 min，待靜置分層后取上清液涂于固體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，取長勢較好的幾株菌落再次平板劃線培養(yǎng)，將菌株進(jìn)行純化，最后進(jìn)行斜面保存與甘油保存。

將純化好的菌種接種到分別含有質(zhì)量濃度10 g/L酒石酸、蘋果酸、檸檬酸的3種液體培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min 培養(yǎng) 5 d[13-15]。按照 GB 5009.157-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品有機(jī)酸的測定》[16]測定有機(jī)酸含量，試驗重復(fù)3次取平均值，篩選出降酸效果較好的菌株并命名，并對降酸效果最優(yōu)的菌株進(jìn)行降酸效果分析。

1.3.2 降酸菌株鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

向YPD液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度20 g/L瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基，將具有最佳降酸效果的菌株在固體培養(yǎng)基上接種1點～3點，于28℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長狀況，對單菌落顏色、形態(tài)與特征進(jìn)行觀察。并取少量菌絲，放于光學(xué)顯微鏡下，觀察分生孢子頭、梗等形狀特點[17-18]。

1.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定

取上述該菌株適量菌體溶于50 μL Takara公司試劑盒（takata lysis buffer for Microorganism to Direct PCR Code No.D304）試劑中變性后離心取上清液作為模板（Template DNA）。反應(yīng)條件為80℃，15 min[19-20]。

PCR反應(yīng)體系為：模板 DNA 3 μL，正向引物（10 pmol/μL）1 μL，反向引物（10 pmol/μL）1 μL，2×TransTaqHiFi PCR SuperMix I 25 μL，16s-free H2O 20 μL，共 50 μL。

PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，55℃20 s，72℃1.5 min，循環(huán) 35次；72℃延伸10 min。

26s rDNA測序：以NL1和NL4為引物，上游引物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'；下游引物 NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

1.3.3 降酸菌株生長特性及耐受性能試驗

1.3.3.1 菌株最適接種量

將降酸菌株孢子懸液以孢子數(shù)12×106CFU/mL稀釋為體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%分別接種到pH 3.0的液體培養(yǎng)基中，在28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，將菌絲體進(jìn)行抽濾，于烘箱中烘至恒重，以菌絲體干重確定最佳接種量。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.2 菌株最適生長溫度

將降酸菌株以體積分?jǐn)?shù)3%接種量將孢子懸液接種在pH 3.0的液體培養(yǎng)基中，分別在20、24、28、32、36℃條件下150 r/min恒溫培養(yǎng)3 d，將菌絲體進(jìn)行抽濾，于烘箱中烘至恒重，以菌絲體干重確定最適生長溫度。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.3 菌株最適生長pH值

將降酸菌株孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)3%分別接種于常溫下 pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0（模擬葡萄有機(jī)酸比例配制酸液調(diào)節(jié)pH值：70%酒石酸、20%檸檬酸、10%蘋果酸）的液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，將菌絲體進(jìn)行抽濾，于烘箱中烘至恒重，以菌絲體干重確定最適生長pH值。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.4 菌株最適生長轉(zhuǎn)速

將降酸菌株孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)3%接種于100mL pH值為3.0的液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下，分別以110、130、150、170、190 r/min 培養(yǎng) 3 d，將菌絲體進(jìn)行抽濾，于烘箱中烘至恒重，以菌絲體干重確定最適生長轉(zhuǎn)速。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.5 菌株傳代降酸特性

將降酸菌株孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)3%接種于100 mL pH值為3.0的液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d。使用接種環(huán)劃線于培養(yǎng)皿并放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用接種針刮下已經(jīng)生長好的菌體，移植到Y(jié)PD培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代。每一代菌種均按1.3.1的方法測定降酸率。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.6 菌株對SO2耐受量

將降酸菌株以體積分?jǐn)?shù)3%的孢子懸液分別接種于含有質(zhì)量濃度 300、350、400、450、500 mg/L 的 SO2液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d后稱量菌絲體干重得到降酸菌株對SO2的耐受量，分別吸取過濾菌絲后的培養(yǎng)液100 μL在固體培養(yǎng)基上涂布，28℃培養(yǎng)3 d后觀察是否有菌落生長。以不添加SO2為對照。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.7 菌株對酒精耐受性

將降酸菌株以體積分?jǐn)?shù)3%的孢子懸液分別接種于含有體積分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%、12%乙醇的液體培養(yǎng)基中（pH 3.0），28℃，150 r/min搖床恒溫培養(yǎng)3 d后稱量菌絲體干重得到降酸菌株對于酒精的耐受量。分別吸取過濾菌絲后的培養(yǎng)液100 μL在固體培養(yǎng)基上涂布，28℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況。以不添加乙醇為對照。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.3.8 菌株致死溫度

將降酸菌株于pH 3.0的液體培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min活化后，取5 mL菌液于離心管中，分別按以下溫度與時間水浴，觀察降酸菌株的致死條件：60℃條件下水浴 20、30 min；65℃條件下水浴 20、30 min；75 ℃條件下水浴 15 s、5、10、15 min；80 ℃條件下水浴 15 s、5、10、15 min；85 ℃條件下水浴 15 s、2、5 min；90 ℃條件下水浴15 s、2、5 min。水浴后分別吸取菌液100 μL在固體培養(yǎng)基上涂布，28℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落的生長情況[21-22]。重復(fù)3次試驗取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸菌株篩選結(jié)果

2.1.1 降酸菌株篩選

篩選出的菌株第一代菌種經(jīng)含酸液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，降酸率結(jié)果如圖1。

圖1 篩選菌株及降酸率對比Fig.1 Strains and their comparison of acid reducing rate

由圖1可見，有8株菌株具有降酸效果，命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8。8 株菌株中，6 株菌株對酒石酸有降酸效果，降酸率10%～30%的有3株，30%～50%有1株，高于50%有2株，分別為菌株S3和S4。5株菌對蘋果酸有降酸效果，降酸率10%～30%的有2株，30%～50%有2株，高于50%有1株，為菌株S4。5株菌株對檸檬酸有降酸效果，降酸率10%～30%的有3株，高于50%有2株，分別為菌株S4和S6。綜合降酸率結(jié)果，選擇降酸效果最優(yōu)的S4菌株進(jìn)行以下分析。

2.1.2 菌株S4降酸效果分析

菌株S4液體培養(yǎng)基含酸量變化如圖2。

圖2 液體培養(yǎng)基的含酸量變化Fig.2 The change of acid content of culture media

由圖2可知，菌株S4對于酒石酸、蘋果酸、檸檬酸降酸率為酒石酸（71.90±0.27）%，含酸量由（10.46±0.08）g/L 降為（2.94±0.05）g/L；蘋果酸（86.33±0.53）%，含酸量由（10.80±0.09）g/L 降為（1.48±0.07）g/L，檸檬酸（72.77±0.46）%含酸量由（11.16±0.07）g/L 降為（3.04±0.07）g/L，降酸前后含酸量經(jīng)過T檢驗得到差異極顯著（p＜0.01）。

2.2 菌株S4形態(tài)學(xué)觀察

菌株S4形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 菌株S4在固體培養(yǎng)基中形態(tài)Fig.3 Morphology of strain S4 in solid medium

圖4 菌株S4在固體培養(yǎng)基中背面形態(tài)Fig.4 Back morphology of strain S4 in solid medium

圖5 菌株S4在顯微鏡下形態(tài)Fig.5 Morphology of strain S4 under microscope

將菌株S4點植于固體培養(yǎng)基中，28℃下恒溫培養(yǎng)5 d。可觀察到菌落生長迅速，菌落為圓形或橢圓形，菌體較厚且呈綠色絨毛狀，中心略有凹陷（見圖3）。平板背面呈淡色，中央呈白色（見圖4）。接入液體培養(yǎng)基中，菌體成長為球狀。經(jīng)過顯微鏡觀察，菌絲各細(xì)胞之間有橫膈膜，菌絲向上突起分生出孢子梗，頂端長出掃帚狀分生孢子，呈綠色。根據(jù)觀察可初步鑒定該菌株為青霉屬（見圖5）。

2.3 菌株S4分子生物學(xué)鑒定

對純化后菌株S4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果為，菌株S4 DNA片段長度為577 bp，見圖6。

圖6PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis of PCR products

將測序結(jié)果輸入Genebank中，利用BLAST功能組件將測得的基因序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比較。選取BLAST結(jié)果中得分較高的株菌的序列，使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖7所示，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可以判定菌株S4為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

圖7 26s rDNA序列的進(jìn)化樹Fig.7 Evolutionary tree based on the 26s rDNA sequence

目前，草酸青霉主要應(yīng)用于果蔬貯藏中與致腐菌的拮抗作用以及降解農(nóng)藥等[23-24]，曾報道應(yīng)用于普洱茶發(fā)酵[25]，因此在未來的試驗中，在對其安全性進(jìn)一步評價后，可利用基因工程手段提取其降酸基因，在酵母菌等中表達(dá)應(yīng)用于果酒降酸，亦可應(yīng)用于含有機(jī)酸的廢水處理等方面。

2.4 菌株S4生長特性

2.4.1 最適接種量

菌株S4最適接種量如圖8所示。

圖8 接種量對菌株S4生長的影響Fig.8 Effect of inoculation quantity on the growth of strain S4

如圖8可見，降酸菌株S4最適接種量為體積分?jǐn)?shù)3%，顯著性水平取α＝0.05，采用統(tǒng)計學(xué)SNK方法得到差異顯著（p＜0.05）。通過觀察發(fā)現(xiàn)接種量高于體積分?jǐn)?shù)3%時，因其菌絲團(tuán)過于密集，菌體出現(xiàn)顏色變深和相互粘連的狀態(tài)。接種量低于體積分?jǐn)?shù)3%時，菌體與營養(yǎng)物質(zhì)接觸不充分，在液體培養(yǎng)基中菌絲團(tuán)較小，因此最適接種量選擇體積分?jǐn)?shù)3%。

2.4.2 最適生長溫度

菌株S4最適生長溫度如圖9所示。

圖9 溫度對菌株S4生長的影響Fig.9 Effect of temperature on the growth of strain S4

如圖9所示，菌株S4最適生長溫度為28℃，顯著性水平取α＝0.05，采用SNK方法得到差異顯著（p＜0.05）。根據(jù)微生物生長特性，培養(yǎng)溫度高于28℃或低于28℃時菌體不能充分生長，因此最佳生長溫度為28℃。

2.4.3 最適生長pH值

菌株S4最適生長pH值如圖10所示。

圖10 pH值對菌株S4生長的影響Fig.10 Effect of pH value on the growth of strain S4

如圖10所示，菌株S4最適生長pH值為3.0，顯著性水平取α＝0.05，采用SNK方法得到差異顯著（p＜0.05）?？勺C明菌株在偏酸環(huán)境下更容易生長，因此適宜應(yīng)用在山葡萄酒釀造中。

2.4.4 最適生長轉(zhuǎn)速

菌株S4最適生長轉(zhuǎn)速如圖11所示。

圖11 生長轉(zhuǎn)速對菌株S4生長的影響Fig.11 Effect of rotation rate on the growth of strain S4

如圖11所示，菌株S4最適生長轉(zhuǎn)速為150r/min，顯著性水平取α＝0.05，采用SNK方法得到差異顯著（p＜0.05）。高于150 r/min時溶氧量急劇升高，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物從而影響菌株生長。轉(zhuǎn)速低于150 r/min時，菌株與氧氣、培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)接觸不充分，導(dǎo)致菌體不能充分生長。

2.5 菌株傳代降酸特性

將菌株S4在培養(yǎng)基中傳代10代以上，以同樣的條件接種及培養(yǎng)后，其降酸結(jié)果如圖12。

圖12 S4菌株傳代數(shù)對降酸率的影響Fig.12 The effect of S4 strain on the acid reducing rate

試驗中發(fā)現(xiàn)其降酸效果會隨著菌株傳代次數(shù)的增加而降低降酸效果，經(jīng)反復(fù)試驗，在菌株為1代～4代時，降酸率較高。但培養(yǎng)至5代～7代，菌株的降酸率大量降低，但在7代以后降酸率趨于穩(wěn)定，酒石酸（20.13±0.27）%，蘋果酸（18.38±0.92）%，檸檬酸（11.85±0.55）%。通過分析菌種來源及篩選過程，原因可能是菌株生長環(huán)境由土壤變?yōu)榕囵B(yǎng)液，其可逐漸適應(yīng)適宜的生長環(huán)境，降酸功能減弱?？稍诤罄m(xù)研究中，從分子生物學(xué)角度對菌株進(jìn)行復(fù)壯研究。

2.6 菌株耐受性能

2.6.1 菌株S4的SO2耐受性能結(jié)果

菌株S4的SO2耐受性能結(jié)果如圖13所示。

圖13 菌株S4 SO2耐受性能Fig.13 SO2tolerance of strain S4

將菌株S4接種到含有SO2的液體培養(yǎng)基中活化，取菌液涂板培養(yǎng)，3 d后平板中均長出大量S4菌落，在含硫量高達(dá)質(zhì)量濃度500 mg/L（p＜0.05）的培養(yǎng)基中仍可生長。由2.4可知，培養(yǎng)基中不添加SO2時，菌絲干重為1.2 g左右，在含有SO2的培養(yǎng)基中，菌株長勢弱于普通培養(yǎng)基但仍可存活。原因可能為SO2對菌株有一定的抑制作用。今后可通過對降酸菌株進(jìn)行馴化富集培養(yǎng)使菌株增強(qiáng)對SO2的耐受性。

2.6.2 菌株S4的酒精耐受性能

菌株S4的酒精耐受性能結(jié)果如圖14所示。

圖14 菌株S4酒精耐受性能Fig.14 Ethanol tolerance of strain S4

將菌株S4在含有酒精的液體培養(yǎng)基中活化后，取菌液涂板培養(yǎng)，3 d后平板中長出大量S4菌落，因此該菌株即使在酒精含量高達(dá)體積分?jǐn)?shù)12%（p＜0.05）的培養(yǎng)基中菌落仍然存活。由2.4所知，培養(yǎng)基中不添加酒精時，菌絲干重為1.2 g左右，在含有酒精培養(yǎng)液中菌株可存活但長勢弱于普通培養(yǎng)基，原因可能為酒精對菌株有一定的抑制作用。今后可通過對降酸菌株進(jìn)行馴化富集培養(yǎng)使菌株增強(qiáng)對酒精的耐受性。

2.6.3 菌株S4的致死溫度試驗

菌株S4的致死溫度試驗結(jié)果如表1所示。

表1 S4致死溫度試驗Table 1 Lethal temperature test of strain S4

通過表1可知，菌株S4在致死條件為60℃～65℃，20 min～30 min時無菌落生長，在 75℃，5min～15 min時無菌落生長，85℃～90℃，2 min～5 min時無菌落生長。因此符合巴氏殺菌條件[26]，不需要過高的滅菌溫度及長時間的滅菌。

3 結(jié)論

從山葡萄生長的土壤中篩選得到8株具有降解有機(jī)酸效果的菌株，篩選出一株降酸效果最佳的菌株S4，對于酒石酸、蘋果酸、檸檬酸降解率分別為（71.90±0.27）%、（86.33±0.53）%、（72.77±0.46）%。經(jīng)多次傳代后，其降酸率下降，但可穩(wěn)定在酒石酸降解率為（20.13±0.27）%，蘋果酸降解率為（18.38±0.92）%，檸檬酸降解率為（11.85±0.55）%。通過形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定該菌株為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。該菌株最適接種量為3%，最適生長溫度為28℃，最適生長pH值為3.0，最適生長轉(zhuǎn)速為150 r/min。其對SO2耐受性>質(zhì)量濃度500 mg/L，對酒精耐受性>體積分?jǐn)?shù) 12%，致死溫度為60℃～65℃，20 min～30 min。