地黃花多糖含量測定及其柱前衍生化HPLC指紋圖譜分析

周艷，張穎，張振凌，*，李雅新，劉彤彤

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450046；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南鄭州450008；4.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450008）

地黃花為玄參科植物地黃（Rehmannia glutionsa Libosch.）的花蕾，有治消渴、腎虛腰痛等功效[1]；《植物名實圖考》異名蜜罐[2]；《本草綱目》曰：“為末服食，功同地黃，腎虛腰脊痛，為末，酒服方寸匕，日三”[3]；《圣濟總錄》中亦有地黃花粥的記載[4]。雖然中國藥典規(guī)定的藥用部位是地黃的地下塊根[5]，地上部分不能入藥。但是隨著中藥資源的不斷開發(fā)和利用被重視[6]，目前已經(jīng)開展了地黃葉化學(xué)成分[7]、藥理作用以及作用機制[8]和地黃葉質(zhì)量控制[9]成份快速分析[10]等方面的研究。而對于地黃花的研究目前較少，僅對鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類成分含量進行了測定[11]，對地黃花多糖抗衰老作用及機制進行了研究[12]，比較了地黃花對秀麗線蟲壽命的影響[13]。目前對中藥中非藥用部位的相關(guān)研究表明，同一種藥用中藥的不同部位在性味、功效上存在較大的類同性，含有相同或相似的化學(xué)成分和藥理作用[6]，本研究在相關(guān)研究文獻基礎(chǔ)上，擬采用水提醇沉法及苯酚-硫酸法對不同時期地黃花及盛花期地黃花不同部位的9批樣品進行多糖的提取和含量測定，同時采用柱前衍生化高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）建立地黃花多糖的指紋圖譜用于分析地黃花多糖中單糖的組成，以期為地黃花的藥用及食用領(lǐng)域的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

鼠李糖對照品（批號：PS010542）、D-葡萄糖對照品（批號：PS160816-03）、阿拉伯糖對照品（批號：PS010529）、D-半乳糖對照品（批號：PS010530）：成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98%；乙腈：北京迪克馬科技有限公司；冰乙酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇：天津富宇精細(xì)化工有限公司；苯酚：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸：煙臺市雙雙化工有限公司；乙酸銨：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。地黃花于2019年4月份采自河南省焦作市武陟縣，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutionsa Libosch.）的花蕾。采摘花蕾期、盛花期和凋零期的地黃花，花蕾期分為剛有花蕾出現(xiàn)的花蕾初期（S1）、花蕾長為2 cm～3 cm且花蕾頭部未見到任何要開放跡象的花蕾中期（S2）、花蕾頂部膨大含苞待放的花蕾后期（S3）；盛花期分為花裂片剛打開的盛花初期（S4）和花裂片已經(jīng)完全打開，且花顏色淺于花開初期的盛花后期（S5）；花剛出現(xiàn)衰敗但未完全枯萎的凋零期（S6），經(jīng)低溫干燥后，選取盛花后期的一部分地黃花從上到下剪開分為花裂片（S7）、花筒上部（S8）、花筒下部（S9）三部分，分別密封避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3200S型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Waters 600-UV 2487高效液相色譜儀：美國Waters公司；FW-200型高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器：成都超純科技有限公司；HH-6儀表恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BT25S型十萬分之一天平、BSA224S-CW型萬分之一天平：賽多利斯科技儀器有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備

取地黃花各樣品粉末約0.15 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入80%乙醇100 mL，加熱回流提取4 h，棄去乙醇液，取出殘渣，揮干乙醇，殘渣置于燒杯中，加水50 mL煎煮1 h，得到多糖提取液，晾涼，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加水定容至刻度，搖勻，從中精密吸取1 mL，加入蒸餾水稀釋4倍，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取D-葡萄糖2.30 mg，置25 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含D-葡萄糖0.092 mg的對照品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，各加水補至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱10 min，取出，置冷水浴中冷卻3 min，另取蒸餾水1 mL，加苯酚溶液和濃硫酸，同上操作作為空白對照，采用紫外-可見分光光度法，在490 nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝0.067 2 x-0.017 9（r＝0.999 7），結(jié)果表明，D-葡萄糖在 2.63 mg/L～13.14 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取“2.1.1”項下S3供試品溶液1 mL，按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為 0.1%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.1.1”項下S3供試品溶液1 mL，按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，每隔30 min測定一次，至150 min，RSD值為1.4%，結(jié)果表明，該樣品在150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗

精密稱取“2.1.1”項下S3樣品粉末6份，各約0.15 g，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，RSD值為1.3%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的S3樣品粉末6份，按照“2.1.1”項方法制備供試品溶液。再精密稱取D-葡萄糖對照品5.21 mg，置于25 mL容量瓶中，配成濃度為0.208 4 mg/mL的溶液。精密吸取0.5 mL各樣品供試液，置于比色管中，分別精密加入180 μL上述D-葡萄糖對照品溶液，然后按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 地黃花多糖的加樣回收率試驗（n=6）Table 1 Recovery test of Rehmannia glutionsa flower polysaccharide（n=6）

2.1.8 樣品含量測定

精密吸取“2.1.1”項下的多糖供試品溶液1 mL，加入蒸餾水稀釋4倍，取稀釋供試品溶液1 mL，按照“2.1.3”項下方法分別測定各樣品吸光度，測定結(jié)果見表2。

表2 地黃花樣品多糖含量結(jié)果Table 2 The polysaccharide content results of Rehmannia glutionsa flower

由表2可知，不同時期地黃花及盛花期不同部位的多糖含量具有一定的差異，其中地黃花花蕾期平均多糖含量為3.98%～4.93%，盛花期平均多糖含量為3.65%～3.78%，盛花期花裂片、花筒上部及花筒下部平均多糖含量分別為3.84%、4.05%及2.93%；地黃花花蕾期平均多糖含量高于盛花期，盛花期不同花部位花筒上部平均多糖含量最高，花裂片其次，花筒下部多糖含量最少。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 對照品溶液制備

取鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖對照品各約2 mg，精密稱定，加水定容至2 mL容量瓶中，搖勻，備用。

2.2.2 供試品溶液制備

取地黃花樣品粉末約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入80%乙醇100 mL，加熱回流提取4 h，棄去乙醇液，取出殘渣，揮干乙醇，殘渣置于燒杯中，加入50 mL蒸餾水煎煮1 h，晾涼，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加水定容至刻度，搖勻，備用。精密吸取上述多糖溶液1 mL于頂空瓶中，加入3.0 mol/L的鹽酸溶液0.5 mL，置110℃烘箱中水解1 h，取出，放涼，用3.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，備用。

2.2.3 單糖衍生化

精密吸取單糖對照品溶液和供試品溶液400 μL，置4 mL離心管中，分別加入0.5 mol/LPMP-甲醇溶液和0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，于70℃下水浴反應(yīng)100 min，取出，放至室溫25℃，加入0.3 mol/L的鹽酸溶液400 μL，最后加入等體積的氯仿溶液，渦旋后靜置，棄去下層，重復(fù)萃取3次，取上層溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.2.4 色譜條件

采用 Waters Symmmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.2 mol/L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，10%A；2 min～5 min，13%A；5 min ～15 min，17%A；15 min ～20 min，17%～19%A；20 min ～30 min，20%A；30 min ～40 min，20% ～37%A；40 min ～50 min，37%A）；流速為 1 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為250 nm；進樣量為10 μL，色譜圖見圖1。

由圖1可知，采用此色譜條件，能夠得到分離度較好的地黃花樣品多糖柱前衍生化高效液相色譜圖，通過與單糖對照品高效液相色譜對比分析，在地黃花樣品多糖柱前衍生化高效液相色譜圖中含有的單糖為鼠李糖、D-葡糖糖、D-半乳糖和阿拉伯糖。

2.2.5 精密度試驗

精密稱取地黃花樣品粉末（S3）約 1 g，按“2.2.2”及“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖，以8號D-葡萄糖的色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD＜0.10%，相對峰面積RSD＜2.84%，表明儀器精密度良好。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取地黃花樣品粉末（S3）約1 g，按“2.2.2”及“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液6份，按“2.2.4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以8號D-葡萄糖的色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD＜0.43%，相對峰面積RSD＜4.01%，表明方法重復(fù)性好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取地黃花樣品粉末（S3）約1 g，按“2.2.2”及“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，分別在 0、2、6、8、12、24 h 按“2.2.4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以8號D-葡萄糖的色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD＜0.27%，相對峰面積RSD＜3.04%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 指紋圖譜的建立及相似度評價

取9批地黃花樣品，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S1作為參照圖譜，選擇平均數(shù)法，時間窗寬度為0.5min，進行多點校正及全譜峰匹配，生成9批地黃花樣品的疊加圖及共有模式圖，見圖3、圖4，共標(biāo)定了10個共有峰，通過與對照品比對分析，共指認(rèn)了4個成分，分別為鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖。

圖2 9批地黃花樣品（S1～S9）的HPLC疊加圖譜Fig.2 HPLC overlay chromatogram of 9 Rehmannia glutionsa flower（S1-S9）

圖3 對照指紋圖譜（R）Fig.3 The fingerprint reference substance（R）

利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”對9批地黃花樣品進行相似度評價，相似度均在0.95以上，說明地黃花不同部位多糖含量雖然不同，但組成多糖的結(jié)構(gòu)相同。結(jié)果詳見表3。

3 結(jié)論與討論

地黃作為常用大宗中藥材，《中國藥典》規(guī)定入藥部位為地黃塊根，目前的研究也主要集中在以塊根為來源的生地黃的品質(zhì)評價[14]和炮制研究[15]及不同炮制工藝對飲片化學(xué)成分[16-17]、質(zhì)量控制[17]和藥理作用上[18]，地黃多糖是地黃發(fā)揮藥效作用的重要活性成分之一[19]，藥理試驗表明地黃多糖具有抗腫瘤[20]、增強免疫力[21]、促進造血[22]、降血糖[23]、抗氧化[24-26]、抗焦慮[27]、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化等作用[28-30]，地黃多糖還可以進一步開發(fā)為脂質(zhì)體[31]和納米疫苗的佐劑輔助發(fā)揮藥物的免疫作用[32-33]。本試驗中對不同開花時期地黃花及盛花期不同花部位多糖含量研究結(jié)果表明，不同開花時期地黃花及盛花期不同部位中多糖含量雖具有一定的差異性，地黃花中多糖含量在花蕾初期和花蕾后期含量相對較高，而后隨花的開放而逐漸減少，總體地黃花花蕾期平均多糖含量在3.98%～4.93%，明顯高于盛花期3.65%～3.78%；地黃花盛花期不同部位多糖含量具有較大的差異性，多糖含量在2.93%～4.05%，其中花筒上部平均多糖含量最高，花裂片其次，花筒下部多糖含量最少，因此若以地黃花為原料進行產(chǎn)品開發(fā)，可考慮將花蕾后期作為地黃花的最佳采收期。

多糖所具有的藥理活性往往與其單糖組成密切相關(guān)，單糖的組成分析是研究多糖結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系的重要內(nèi)容。本試驗采用柱前衍生化HPLC指紋圖譜對不同開花時期地黃花及盛花期不同花部位多糖單糖組成進行了研究，結(jié)果表明：不同時期地黃花及花朵盛期不同部位的多糖中單糖組成相似，均含有鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和阿拉伯糖，這與張艷萍等的研究[34]中生地黃多糖SRPⅠ的單糖組成相一致。地黃花多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.11%、66.46%、3.93%和21.50%。

本課題組曾對地黃花不同部位梓醇等有效成分進行比較分析[11]，結(jié)果表明，地黃花不同部位梓醇等有效成分含量雖存在很大差異，但其含量均較高。地黃作為臨床常用大宗中藥，主產(chǎn)于河南、山西、山東、河北等地，種植區(qū)域廣泛，而在臨床應(yīng)用時采用的只有其塊根，其余部分一般作為廢棄物而丟棄不用，很少對非藥用部位進行更多的研究以充分地綜合利用中藥的資源，近年來隨著地黃的市場需求量不斷增加以及由于地黃的連作障礙和土地資源有限等原因?qū)е碌攸S資源相對緊缺，地黃葉的開發(fā)利用開始逐漸被研究者所關(guān)注[7-10]，而地黃花同樣作為植株的重要組成部分，在花期具有較大的生物量，地黃多糖、環(huán)烯醚萜苷及苯乙醇苷類成分作為地黃重要的有效成分[19]，在地黃花中的含量同樣較高，加上地黃花多糖具有一定的抗衰老作用，因此本研究認(rèn)為對地黃的非藥用部位——地黃花的藥用和食用相關(guān)領(lǐng)域進行開發(fā)，不僅可以提高中藥資源的利用度及種植的附加值，同時也可帶來廣闊的社會效益和經(jīng)濟效益。