HPV E6/E7檢測(cè)在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值

陳玉茵 任源源 陳雁南

宮頸癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤之一，是由宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展而來(lái)，我國(guó)新發(fā)病例約占世界發(fā)病率的1/3，長(zhǎng)期位居世界第二[1-2]。宮頸癌發(fā)病的因素比較多，與人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染密切相關(guān)，99%以上的宮頸癌組織中都可檢測(cè)到HPV DNA[3]。HPV是一類(lèi)能特異感染人的皮膚和黏膜的環(huán)狀DNA病毒，根據(jù)HPV亞型與腫瘤發(fā)生的關(guān)系可將HPV分為低中危型和高危型，高危型HPV包括HPV 16、18、31和33等，可在不同程度上參與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變與宮頸癌的發(fā)生[4-5]?，F(xiàn)代研究顯示宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)從正常到炎性進(jìn)而發(fā)展成腫瘤，同時(shí)伴有多基因改變逐漸積累的多步驟過(guò)程，在此過(guò)程中伴隨所有癌基因、抑癌基因和生長(zhǎng)因子基因等多種基因的改變相關(guān)[6-7]。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)是一種以E6/E7為靶點(diǎn)的篩查手段，也是近年出現(xiàn)的一項(xiàng)新的宮頸癌篩查技術(shù)[8-9]。當(dāng)宿主初始感染HPV時(shí)，病毒基因不與宿主的基因相整合，HPV E6/E7 mRNA呈現(xiàn)為低表達(dá)狀況；而在性傳播疾病、慢性炎癥、吸煙等因素的刺激下，宿主基因處于相對(duì)不穩(wěn)定狀態(tài)，E6/E7mRNA大量轉(zhuǎn)錄，HPV表現(xiàn)為持續(xù)感染狀態(tài)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的正常周期失控，進(jìn)而誘發(fā)宮頸癌的發(fā)展[10-11]。本文具體探討了HPV E6/E7檢測(cè)在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，2014年6月到2019年6月選擇本院進(jìn)行宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)篩查的患者62例，納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；液基薄層細(xì)胞檢測(cè)為宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變級(jí)(由3位中級(jí)及以上職稱(chēng)病理科醫(yī)師為所有切片進(jìn)行獨(dú)立閱片，參考女性生殖系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn))；檢查前術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療；年齡20～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有宮頸癌病史者；有免疫缺陷疾病患者；臨床資料缺項(xiàng)者；孕期或產(chǎn)后6周以?xún)?nèi)者；已接種疫苗或計(jì)劃接種HPV疫苗者；已行全子宮切除術(shù)者；有嚴(yán)重的自身免疫性疾病患者。

年齡最小28歲，最大78歲，平均年齡(47.49±2.39)歲；平均病程(3.14±0.15)年；平均體重指數(shù)(22.48±1.27)kg/m2；病理程度：CIN Ⅰ級(jí)30例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)9例，宮頸癌5例。

1.2 HPV DNA檢測(cè)

所有患者取膀胱截石位，用一次性宮頸采樣刷采集宮頸樣本，將刷子放入裝有細(xì)胞保存液的瓶中，然后進(jìn)行HPV檢測(cè)(Hologic公司的Cervista HR-HPV DNA檢測(cè)試劑盒)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，以HPV基因組L1區(qū)為靶區(qū)域，通過(guò)信號(hào)放大法，檢測(cè)HPV16/18 DNA水平。結(jié)果判讀：①HPV陰性；②HPV16/18陽(yáng)性，指基因型16和(或)18陽(yáng)性。

1.3 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)

取1.2中的樣本，采用捕獲雜交法進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA的全自動(dòng)檢測(cè)(上海生工公司HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒)，并根據(jù)HPV E6/E7mRNA試劑盒的陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)判定并統(tǒng)計(jì)檢測(cè)陽(yáng)性率。

1.4 p53與Ki-67免疫組化方法

鼠抗人p53單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體都購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；免疫組化通用型染色試劑盒、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。取1.2中的樣本處理為病理切片，厚度為2 μm，采用二甲苯、乙醇進(jìn)行透明化與脫水處理。蘇木精復(fù)染組織切片15～30 s，使用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。每張切片均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，以宮頸癌組織為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，Ki-67、p53陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核中，染色強(qiáng)度陰性為0分，染色弱但強(qiáng)于陰性對(duì)照為1分，染色清晰為2分，染色強(qiáng)為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，>10%～30%為1分，>30%～60%為2分，>60%為3分，上述兩種評(píng)分相加：0～1分為陰性(-)、2分為弱陽(yáng)性(+)、3～4分為中陽(yáng)性(++)、5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，(+)、(++)、(+++)為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

選擇SPSS 22.00軟件對(duì)本研究的計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，對(duì)比為卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPV DNA陽(yáng)性率對(duì)比

CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的HPV DNA陽(yáng)性率分別為33.3%(10/30)、77.8%(14/18)、88.9%(8/9)和100.0%(5/5)，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.673，P<0.001)。

2.2 HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率對(duì)比

CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率分別為33.3%(10/30)、83.3%(15/18)、88.9%(8/9)和100.0%(5/5)，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.617，P<0.05)。

2.3 P53、Ki67陽(yáng)性率對(duì)比

CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的P53、Ki67陽(yáng)性率分別為30.0%、66.7%、88.9%、100.0%和33.3%、72.2%、77.8%和100.0%，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同CIN病理級(jí)別的P53、Ki67陽(yáng)性率對(duì)比(例，%)

2.4 相關(guān)性分析

在62例患者中，Pearson相關(guān)分析顯示HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率都與HPV DNA、P53、Ki67陽(yáng)性率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率與其他指標(biāo)的相關(guān)性(n=62)

3 討論

宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了，不過(guò)HPV持續(xù)感染是重要的病因[12]。傳統(tǒng)的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查比較便捷，技術(shù)也比較簡(jiǎn)單，但是存在敏感性與特異性都比較低等不足[13]。有研究顯示在性活躍女性中，HPV感染率可高達(dá)30%，有性行為的婦女感染至少一種HPV的幾率在70%以上。不過(guò)多數(shù)為一過(guò)性感染，說(shuō)明很多機(jī)體HPV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果，但并不會(huì)發(fā)展為宮頸病變[14]。本研究顯示CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的HPV DNA陽(yáng)性率分別為31.9%、75.6%、95.0%和100.0%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。特別是本研究采用檢測(cè)技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)HPV 16/18基因型，減少了細(xì)胞學(xué)檢查數(shù)量，也可進(jìn)一步減少對(duì)細(xì)胞學(xué)醫(yī)師的依賴(lài)，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)[15]。當(dāng)前也有研究顯示與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查相比，HPV DNA檢測(cè)在檢出高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變上具有更好的靈敏性，且宮頸癌的預(yù)防效果比以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)的篩查方案高60%左右[16]。 不過(guò)大量的HPV DNA陽(yáng)性結(jié)果會(huì)給婦女造成過(guò)多的心理負(fù)擔(dān)，且造成過(guò)多的轉(zhuǎn)診與復(fù)查[17]。

HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)是HPV引起子宮頸病變的一個(gè)重要步驟，也可反映HPV的潛在致癌能力，其表達(dá)量與宮頸病變狀況有高度的相關(guān)性[18]。本研究顯示CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率分別為33.3%、80.5%、90.0%和100.0%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)前也有研究顯示HPVE6/E7mRNA的表達(dá)代表著癌基因的活動(dòng)狀況，進(jìn)而可以判定感染風(fēng)險(xiǎn)高低，用于指導(dǎo)臨床治療。HPV感染多為一過(guò)性，只有持續(xù)性的HPV感染才容易發(fā)展為宮頸癌，為此檢測(cè)HPVE6/E7mRNA 是檢測(cè)機(jī)體內(nèi)病毒活性的重要方法[19-20]。Ki-67 是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，也是預(yù)測(cè)宮頸 CIN 和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中有重要參考價(jià)值的標(biāo)志物，其表達(dá)程度可反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[21]。p53基因是定位于人染色體17p13.1的一種重要的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物p53蛋白是在細(xì)胞分裂和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，p53蛋白正常表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與引起細(xì)胞周期阻滯，p53蛋白突變可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和過(guò)度增殖而產(chǎn)生腫瘤行為[22]。本研究顯示CIN Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、宮頸癌的P53、Ki67陽(yáng)性率分別為31.9%、68.3%、85.0%、100.0%和33.3%、70.0%、80.8%和100.0%，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明P53、Ki67在預(yù)測(cè)宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生發(fā)展中具有重要價(jià)值，對(duì)腫瘤的治療和預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義。

雖然HPV是宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)生的必要條件，但HPV感染并非均導(dǎo)致宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生。大多數(shù)HPV感染者屬亞臨床感染型或潛伏病毒感染[23]，單純HPV感染不足以引起宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變，從HPV感染發(fā)展到宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變還有賴(lài)于其他因素協(xié)同作用[24]。本研究Pearson相關(guān)分析顯示宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率都與HPV DNA、P53、Ki67陽(yáng)性率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性(P<0.05)。從機(jī)制上分析，HPV E6與E6相關(guān)蛋白結(jié)合后形成復(fù)合物后，從而發(fā)揮降解P53的作用。E7 則可以結(jié)合和失活PRb，從而干擾細(xì)胞周期調(diào)控，使基因異常的細(xì)胞增殖失控而最終導(dǎo)致癌變[25]。P53的過(guò)表達(dá)已被證明與HPV DNA轉(zhuǎn)化感染的啟動(dòng)有顯著相關(guān)性，HPV DNA感染可導(dǎo)致了細(xì)胞的增殖加快，使得Ki67表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量顯著增多[26]。本研究也有一定不足，實(shí)驗(yàn)病例數(shù)較少，相對(duì)局限，且沒(méi)有設(shè)置健康人群，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，隨著宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變級(jí)別的增加，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率增加，也伴隨有HPV DNA、P53、Ki67陽(yáng)性率增加，兩者具有相關(guān)性。