miR-145介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路對(duì)乳腺癌患者治療及預(yù)后的影響

楊 斌 汪嫣嫣 甘家兵

乳腺癌在女性中具有較高的發(fā)病率以及病死率[1]，發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境、病毒等因素有關(guān)[2]，主要通過(guò)根治術(shù)進(jìn)行治療[3]，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，此病極易復(fù)發(fā)[4]。miRNA是非編碼小分子RNA中的一員，具有高度的保守性、特異性以及差異性，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖凋亡具有一定的調(diào)控作用[5-6]。而TGF-β/Smad信號(hào)通路對(duì)于腫瘤的發(fā)生進(jìn)展也有一定的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-145以及TGF-β/Smad信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白，并探討其對(duì)乳腺癌治療及預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

將我院2016年6月至2019年10月治療的114例乳腺癌患者納入研究，患者平均年齡在(49.29±6.16)歲。TNM分期：Ⅰ期患者35例，Ⅱ～Ⅲ期49例，Ⅳ期30例。導(dǎo)管癌有51例，小葉癌有31例，濕疹樣癌有32例。各分期患者年齡、性別等基本資料之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①病理學(xué)檢查確定其為乳腺癌；②符合WHO乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)；③無(wú)腫瘤病史者；④獲得患者及其親屬的認(rèn)同。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重臟器功能不全患者；②有其他惡性腫瘤并發(fā)患者；③已治療患者；④無(wú)完整臨床資料者。本研究經(jīng)我院的倫理委員會(huì)審核通過(guò)。所有患者均行乳腺癌根治術(shù)治療，手術(shù)中留取癌組織，手術(shù)后根據(jù)患者治療情況適當(dāng)進(jìn)行放化療。

1.2 RT-PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá)

檢測(cè)手術(shù)中留存的癌組織以及癌旁組織標(biāo)本，依照試劑盒(北京原平皓生物，HF104-01)說(shuō)明書通過(guò)Trizol的方法對(duì)總RNA進(jìn)行提取、定量，依循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen，205111)步驟合成cDNA，后依RT-PCR試劑盒(Transcriptor cDNA Synth.Kit 2，上海臻諾生物科技)指導(dǎo)檢測(cè)miR-145的表達(dá)，以U6為內(nèi)參，最后通過(guò)2-△△Ct公式獲得結(jié)果。

1.3 Western blot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

消化、離心獲得的能夠穩(wěn)定表達(dá)miR-145的癌組織，SDS-PAGE電泳獲得相關(guān)蛋白，冷凍保存，加入PBST稀釋的一抗，泡入PVDF膜后于4 ℃條件下孵育12 h，轉(zhuǎn)膜后加入二抗，室溫下孵育2 h，洗脫，顯色，成像，Image J軟件分析，從而獲得相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.4 隨訪

對(duì)患者按照前兩年三個(gè)月一次，后一年六個(gè)月一次的時(shí)間段進(jìn)行隨訪，方式分為電話、門診等，對(duì)患者的術(shù)后癥狀、治療、生存情況等進(jìn)行記錄，隨訪結(jié)束點(diǎn)為日期截止或患者失訪、死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-145的表達(dá)情況

對(duì)患者miR-145的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，癌旁組織、Ⅰ期乳腺癌組織、Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌組織及Ⅳ期乳腺癌組織的相對(duì)表達(dá)量分別為(5.28±1.03)、(4.91±0.71)、(4.02±0.65)及(3.19±0.33)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.273，P<0.05)。與癌旁組織相比，治療前Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌組織中miR-145的表達(dá)降低，并且其表達(dá)水平隨著TNM分期的上升而有所下降(P<0.05)。

2.2 TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

將治療前后各組織中的相關(guān)蛋白進(jìn)行對(duì)比，與癌旁組織相比，Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌組織中TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin的表達(dá)均有所上升(P<0.05)，且隨著TNM分期的上升而上升(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

圖1 TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 miR-145與TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)系

將miR-145與TGF-β/Smad信號(hào)通路的相關(guān)蛋白行相關(guān)性分析，miR-145與TGF-β1、Smad3、Gli2、Vimentin呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 miR-145的水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

如表3所示，miR-145的水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及增殖指數(shù)有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、ER、PR以及HER-2無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表1 TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 miR-145與TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)系

表3 miR-145的水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 乳腺癌患者生存影響因素的COX回歸分析

如表4所示，通過(guò)回歸分析，得出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-145、TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin是乳腺癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表4 乳腺癌的生存因素分析

2.6 miR-145及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白與預(yù)后的關(guān)系

以乳腺癌患者miR-145、TGF-β1、Smad3中位數(shù)為界分為miR-145高表達(dá)、miR-145低表達(dá)與TGF-β1高表達(dá)、TGF-β1低表達(dá)及Smad3高表達(dá)、Smad3低表達(dá)。Kaplan-Meier法行生存率分析發(fā)現(xiàn)，miR-145高表達(dá)組的總生存率要高于低表達(dá)組的生存率(P<0.05)，TGF-β1、Smad3低表達(dá)的總生存率比高表達(dá)組的生存率高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

作為女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤，乳腺癌發(fā)病率逐步上升[8]，原位乳腺癌雖不致命，但隨著乳腺癌細(xì)胞在重要器官中的轉(zhuǎn)移，會(huì)對(duì)患者的正常組織有所破壞，從而威脅患者生命[9-10]。臨床上多使用根治性手術(shù)聯(lián)合化學(xué)治療[11]，但由于其復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移，此疾病通常具有不良的預(yù)后效果[12]，因而對(duì)其相關(guān)機(jī)制以及影響因素進(jìn)行探討至關(guān)重要。

有研究顯示，乳腺癌與遺傳、病毒等因素有關(guān)[13]，因而越來(lái)越多的研究者對(duì)miRNA在腫瘤中的作用進(jìn)行研究。miRNA是1種極小的非編碼RNA，極度保守、特異[14]，可以通過(guò)對(duì)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程進(jìn)行降解和抑制，來(lái)對(duì)有關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮有關(guān)生物學(xué)功能，參與機(jī)體的病理生理過(guò)程[15]。余杰等[16]對(duì)已有一定了解的miR-31-5p進(jìn)行研究，探究其在乳腺癌細(xì)胞中的有關(guān)機(jī)制，他們通過(guò)對(duì)該細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染，檢測(cè)其中miR-31-5p的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，最終得出miR-31-5p可調(diào)控乳腺癌的放化療情況，其過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌的放化療具有促進(jìn)作用；又如任暉等[17]通過(guò)檢測(cè)miR-124的表達(dá)，細(xì)胞侵襲、增殖的情況以及雙熒光素酶鑒定miR-124與SP1的關(guān)系，了解到miR-124的過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控SP1來(lái)抑制乳腺癌的進(jìn)展。除此之外，miR-367、miR-130a-3p、miR-221等對(duì)乳腺癌也均有一定的調(diào)控作用。

圖2 乳腺癌患者的生存率比較

本研究對(duì)我院2016年6月至2019年10月治療的114例乳腺癌患者進(jìn)行研究，對(duì)所有患者手術(shù)化療治療前后的癌組織、癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。miR-145處于染色體9q31上，對(duì)于腫瘤進(jìn)展具有抑制作用[18]，RT-PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，治療前Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌組織中miR-145的表達(dá)與癌旁組織相比均降低，并且隨著TNM分期的上升其表達(dá)水平有所下降(P<0.05)，這一結(jié)果提示乳腺癌中miR-145呈現(xiàn)低表達(dá)的趨勢(shì)，miR-145的水平可能預(yù)示著乳腺癌患者的病情程度。有研究表明，TGF-β/Smad信號(hào)通路與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、人體腫瘤的發(fā)生進(jìn)展具有息息相關(guān)的作用，TGF-β1是人體內(nèi)TGF-β的主要存在形式，對(duì)于Smad以及癌基因突變具有一定的誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移[19]。進(jìn)而經(jīng)WB檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌組織中TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin的表達(dá)與癌旁組織相比均有所上升(P<0.05)，且隨著TNM分期的上升而上升，提示著TGF-β/Smad通路對(duì)乳腺癌的增殖具有一定的促進(jìn)誘導(dǎo)作用。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-145與TGF-β1、Smad3、Gli2、Vimentin呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示miR-145可能下調(diào)TGF-β/Smad信號(hào)通路。而將miR-145的水平與乳腺癌患者臨床病理特征施以相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-145的水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及增值指數(shù)有關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步使用COX回歸分析以及Kaplan-Meier法行生存率分析得出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-145、TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin是乳腺癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。miR-145高表達(dá)組的總生存率要比低表達(dá)組的生存率高(P<0.05)，TGF-β1、Smad3低表達(dá)的總生存率要比高表達(dá)組的生存率高(P<0.05)。表明高表達(dá)的miR-145及低表達(dá)的TGF-β1、Smad3對(duì)患者具有較好的預(yù)后效果。

綜上，miR-145在乳腺癌患者中呈低表達(dá)，TGF-β/Smad信號(hào)通路則呈高表達(dá)。臨床可能通過(guò)下調(diào)TGF-β/Smad信號(hào)通路使患者預(yù)后效果達(dá)到較佳。