湖北貝母石油醚段的抗菌活性和化學(xué)成分研究

方詩(shī)琪，李 宇，黃東海，艾倫強(qiáng)，3，劉翠君，3，何美軍，3

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗(yàn)站，湖北 恩施 445000；3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心藥材分中心，湖北 恩施 445000）

湖北貝母（Fritillaria hupehensis Hsiao et k. c.Hsia）為百合科植物，又稱鄂貝、板貝、窯貝、奉貝［1］，主產(chǎn)于鄂西、湘西北及川東等地區(qū)，安徽、河南也有少量分布。湖北貝母以地下鱗莖入藥，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，常用于治療熱痰咳嗽、陰虛肺燥、痰核瘰疬、肺癰瘡毒等癥［2］。湖北貝母在《中國(guó)藥典》［3］和《中國(guó)植物志》［4］中都有收錄。湖北貝母作為鄂西南山區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱，受到了越來(lái)越多的重視［5］。

由于細(xì)菌耐藥性和抗生素失效等問(wèn)題，2017 年2 月27 日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)表了“全球優(yōu)先事項(xiàng)”：研究抗生素以及抗性細(xì)菌，以指導(dǎo)新抗生素的研究、發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)［6］。為推動(dòng)湖北貝母資源利用并挖掘新的抗生素以及解決抗生素失效等臨床問(wèn)題，本研究運(yùn)用湖北貝母石油醚段對(duì)10 株臨床耐藥菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)試并探索了其抗菌機(jī)制，并在湖北貝母石油醚段的抗菌活性和機(jī)制探索的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)成分的初步探索。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker maXis 高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；Aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS 聯(lián)用 儀；Agilent 1260 高效液相色譜儀（配DAD 檢測(cè)器），Phenomenex色譜柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）；Agilent Poroshell反相色譜柱120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；HS-GF254 硅膠薄層板；J&K 色譜純乙腈。

所有臨床致病菌經(jīng)中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定。所用湖北貝母樣品是采集于湖北省恩施市的人工種植品，經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所由金文副研究員鑒定為湖北貝母鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 湖北貝母石油醚段抗菌活性測(cè)試 409.8 g干燥湖北貝母磨成粉，加入60% 乙醇溶液2 L，冷浸24 h，200 W 超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮回收溶劑。浸膏用石油醚萃取3 次，每次2 L，分液，合并石油醚層，減壓濃縮回收石油醚，得到石油醚段浸膏0.527 4 g。DMSO 溶解得到的石油醚組分浸膏（0.174 1 g/mL），用于后續(xù)致病菌相關(guān)試驗(yàn)。

采用濾紙片法［7］測(cè)定湖北貝母石油醚段對(duì)10株臨床耐藥菌的抑菌活性。DMSO 溶解湖北貝母石油醚段，用打孔器將濾紙打成直徑6 mm 的圓片，滅菌后在培養(yǎng)箱中烘干。取100 μL 培養(yǎng)至OD600nm為0.6 的測(cè)試菌菌液與20 mL LB 固體培養(yǎng)基（微波爐融化，冷卻至不燙手）混合均勻倒平板。將濾紙片置于混有菌液的培養(yǎng)基上，取5 μL 湖北貝母石油醚段（DMSO 溶液溶解）于濾紙片上，使濾紙片完全吸收。根據(jù)藥理學(xué)試驗(yàn)方法判斷：抑菌圈＜10 mm 為耐藥和無(wú)抑菌作用；10 mm 為輕度敏感；11～15 mm 為中度敏感；—16 mm 為高度敏感?？股氐囊志σ耘R床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 湖北貝母石油醚段抗菌活性MIC（最低抑菌濃度）/MBC（最低殺菌濃度）測(cè)定 采用稀釋倒平板法（Pour plate method）［8］測(cè)定湖北貝母石油醚段對(duì)10 株臨床耐藥菌的MIC。用DMSO 溶液溶解湖北貝母石油醚段，加入到20 mL LB 固體培養(yǎng)基（微波爐融化，冷卻至不燙手），形成系列含有不同湖北貝母石油醚段濃度（50、20、10、5、3、2、1、0.5、0.2、0.1 mg/mL）的平板。取10 μL 培養(yǎng)至OD600nm為0.6 的測(cè)試菌菌液于試驗(yàn)平板涂板，培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)計(jì)算抑制率。

1.2.3 湖北貝母石油醚段對(duì)致病菌生長(zhǎng)曲線影響檢測(cè) 利用超微量紫外分光光度計(jì)［9］測(cè)定湖北貝母石油醚段對(duì)3 株生長(zhǎng)抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）生長(zhǎng)的影響。接種0.5 mL 適宜濃度（約100 CFU/mL）的菌懸液至裝有50 mL LB 培養(yǎng)基3 個(gè)250 mL 錐形瓶（高壓滅菌）中，并編號(hào)為1、2、3。向1、2 號(hào)錐形瓶中分別加入使其終濃度達(dá)到1×MIC 和2×MIC，于37 ℃下150 r/min 培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h 在無(wú)菌條件下取樣，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 湖北貝母石油醚段對(duì)致病菌菌液電導(dǎo)率影響檢測(cè) 利用電導(dǎo)儀［10］測(cè)定湖北貝母石油醚段對(duì)3株生長(zhǎng)抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌液離子濃度［10］。將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期致病菌菌液用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，菌液濃度調(diào)到108CFU/mL，取5 mL，分別加入使其終濃度達(dá)到1×MIC 的湖北貝母石油醚段，每隔10 min 測(cè)定1 次電導(dǎo)率。

1.2.5 湖北貝母石油醚段對(duì)致病菌菌液內(nèi)容物釋放檢測(cè) 利用超微量紫外分光光度計(jì)［11］測(cè)定湖北貝母石油醚段對(duì)3 株生長(zhǎng)抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌液中菌液內(nèi)容物釋放。將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的50 mL 致病菌菌液在4 000 r/min 離心15 min 收集菌體，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，90 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）重懸菌體，分裝3 個(gè)100 mL 錐形瓶中，并標(biāo)記為1、2、3 號(hào)，向1、2 號(hào)錐形瓶中分別加入湖北貝母石油醚段，使其終濃度達(dá)到1×MIC，以加有等體積DMSO 的3 號(hào)菌懸液為對(duì)照，將各錐形瓶置于37 ℃下150 r/min 培養(yǎng)6 h，期間每隔2 h在無(wú)菌條件下取樣，菌懸液在8 000 r/min 離心5 min，取上清液在260 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度以反映菌懸液中核酸等內(nèi)容物含量。

1.2.6 湖北貝母石油醚段化合物GC-MS 分析 氣相色譜條件：agilent 19091S-433 毛細(xì)管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）；升溫程序：60 ℃保持2 min，5 ℃/min 升至240 ℃，保持2 min，然后10 ℃/min 升至280 ℃，保持2 min，總運(yùn)行時(shí)間23 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為高純度氦氣（99.999%）；流速為1.8 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 amu，檢索譜庫(kù)為NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。

1.2.7 湖北貝母石油醚段化合物分離鑒定 稱取干燥湖北貝母鱗莖20 kg，粉碎，過(guò)40 目篩，共用40 L的60% 乙醇溶液萃取，采用60% 乙醇溶液100 L 冷浸提取96 h，過(guò)濾，減壓濃縮回收乙醇，得到浸膏800.27 g。浸膏加1 L 水懸浮，再加3 倍體積的石油醚萃取3 次，分液，合并石油醚相，減壓回收石油醚，得到貝母石油醚段浸膏80.2 g。

湖北貝母石油醚段浸膏采用硅藻土拌樣，硅膠柱層析（Φ10 cm×50 cm）分離，以石油醚/乙酸乙酯體系（100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100，V/V）洗脫，得到8 個(gè)組分Fr.A1 至Fr.A8。根據(jù)HPLC 和TLC 分析結(jié)果，將Fr.A4 至Fr.A6 合并正向硅膠分離，以石油醚/氯仿體系（100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、80∶20，V/V，下同）洗脫，得到10 個(gè)組分Fr.B1至Fr.B10。根據(jù)HPLC 分析，經(jīng)半制備HPLC、ODS色 譜 柱（250 mm×10 mm，5 μm）分 離Fr. B5，以CH3CN/H2O（90∶10 至100∶0）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物1（tR 21.7 min，4 mg）。組分Fr.B6 至Fr.B7 合并，經(jīng)半制備HPLC、ODS 色譜柱分離，以CH3CN/H2O（85∶15）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物3（tR 24.5 min，10 mg）。組分Fr.B8 走凝膠柱，以丙酮洗脫，得到化合物2（100 mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖北貝母石油醚段的抗菌活性

湖北貝母石油醚段浸膏為0.527 4 g，浸膏得率為0.129%。湖北貝母石油醚段對(duì)蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌有中度敏感抑制活性（抑菌圈為11～15 mm），對(duì)肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有輕度敏感抑制活性（抑菌圈—10 mm）。

表1 湖北貝母石油醚段的抗菌活性

2.2 湖北貝母石油醚段抗菌活性MIC 和MBC

基于湖北貝母石油醚段對(duì)于蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有中度或輕度敏感抑制活性，本研究進(jìn)一步考察其對(duì)應(yīng)的MIC 和MBC［12］。如果MBC/MIC＞4，則認(rèn)為抗生素具有抑菌作用；如果MBC/MIC＜4，則認(rèn)為具有殺菌作用［13］。湖北貝母石油醚段對(duì)3 株致病菌：蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC/MIC 均小于4.0，且其MIC 都在2 mg/mL 以下；對(duì)肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213 的MBC/MIC 大于4.0。

表2 湖北貝母石油醚段的抗菌MIC 和MBC

2.3 湖北貝母石油醚段對(duì)致病菌生長(zhǎng)的影響

基于湖北貝母石油醚段對(duì)3 株致病菌：蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC/MIC 小于4.0，且其MIC 都在2 mg/mL 以下，本試驗(yàn)探究了湖北貝母石油醚段對(duì)這3 株致病菌生長(zhǎng)過(guò)程的影響。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示湖北貝母石油醚段對(duì)綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B）、枯草芽孢桿菌（圖1C）相對(duì)于各自細(xì)菌的對(duì)照組（DMSO）均有顯著的抑制生長(zhǎng)作用，試驗(yàn)組生長(zhǎng)緩慢。隨著處理濃度由1/2×MIC 升為1×MIC 時(shí)，菌體的生長(zhǎng)進(jìn)一步變緩。但湖北貝母石油醚段對(duì)3 種菌的抑制模式不盡相同，對(duì)于綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B），在藥物的作用下遲緩期明顯增長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期的斜率變緩，從而達(dá)到抑制生長(zhǎng)的結(jié)果；而對(duì)于枯草芽孢桿菌（圖1C），藥物沒(méi)有將細(xì)菌大幅度阻遏在遲緩期，主要通過(guò)減緩對(duì)數(shù)期的斜率達(dá)到抑制生長(zhǎng)。相較枯草芽孢桿菌（圖1C）主要抑制對(duì)數(shù)期而言，湖北貝母石油醚段對(duì)于綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B）抑制模式的抑制力度更大，這與前述抑菌圈試驗(yàn)以及MBC/MIC 的結(jié)果相互佐證。

圖1 湖北貝母石油醚段對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.4 湖北貝母石油醚段對(duì)細(xì)菌膜通透性的影響

致病菌菌液電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示，湖北貝母石油醚段使得綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液的離子濃度先降低，再緩慢上升。推測(cè)其可能的機(jī)制是湖北貝母石油醚段中酚酸類有機(jī)酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面，使得菌液離子濃度和電導(dǎo)率下降。有機(jī)酚酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，與細(xì)胞膜前期靜電相互作用，逐漸造成膜破壞、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)鉀離子、鈉離子、氫離子、核酸等帶電離子滲漏，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)［14］報(bào)道基本一致。

2.5 湖北貝母石油醚段對(duì)菌懸液中大分子內(nèi)容物含量的影響

超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果（圖3）顯示，湖北貝母石油醚段使得綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液中核酸濃度隨時(shí)間上升。推測(cè)其可能的機(jī)制是湖北貝母石油醚段中的酚酸類有機(jī)酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，與細(xì)胞膜前期靜電相互作用，逐漸造成膜破壞、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)大分子核酸、蛋白質(zhì)等滲漏，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)［15］報(bào)道基本一致。

圖2 湖北貝母石油醚段對(duì)致病菌菌液電導(dǎo)率的影響

圖3 湖北貝母石油醚段對(duì)菌懸液中核酸類物質(zhì)含量的影響

2.6 湖北貝母石油醚段化合物分離鑒定

湖北貝母石油醚段揮發(fā)油用丙酮稀釋，得到了湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流，并根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行了比對(duì)，得到了對(duì)應(yīng)的27 種化合物（圖4）。從表3 可以看出，GC-MS 成分中含有較多的脂肪酸類化合物和甾醇類化合物，對(duì)湖北貝母石油醚段化合物的分離鑒定提供了指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)湖北貝母石油醚段對(duì)蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌有中度敏感抑制活性，對(duì)肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有輕度敏感抑制活性。通過(guò)抗菌機(jī)制探索，湖北貝母石油醚段很可能通過(guò)破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)K＋、Na＋、H＋等帶電離子滲漏以及一些大分子胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，從而減緩了蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌生長(zhǎng)，達(dá)到抗菌的效果。由于湖北貝母石油醚段有抗菌活性，本研究進(jìn)而對(duì)湖北貝母石油醚段成分進(jìn)行了探索，獲得了湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流，并根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行了比對(duì)，得到了對(duì)應(yīng)總離子流中27 種化合物。湖北貝母石油醚段的優(yōu)良抗菌活性和抗菌廣譜性為研發(fā)優(yōu)質(zhì)植物來(lái)源的天然抗生素提供了基礎(chǔ)。

表3 湖北貝母石油醚段主要成分

圖4 湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流