百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性及安全性評(píng)價(jià)

劉開(kāi)放， 楊治國(guó)， 林 偉＊

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院， 河南信陽(yáng)464000）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱小龍蝦，是我國(guó)一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，克氏原螯蝦味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-3]，深受消費(fèi)者的喜歡，但是野生的產(chǎn)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)上的需求[4，5]。隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖和生態(tài)養(yǎng)殖的推動(dòng)，稻蝦綜合種養(yǎng)模式成為最主要的養(yǎng)殖模式，該模式下養(yǎng)殖的小龍蝦產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的60%以上[6，7]。稻蝦綜合種養(yǎng)能達(dá)到“一水兩用，一田雙收”，但是，稻田發(fā)生病蟲(chóng)害時(shí)農(nóng)藥的使用直接導(dǎo)致養(yǎng)殖蝦死亡或嚴(yán)重影響其成活率，影響蝦的產(chǎn)量[8]。有研究表明：在使用農(nóng)藥過(guò)程中，僅有1%作用于植物上，其余部分間接或直接進(jìn)入土壤水體中，對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象造成不同程度的影響[9]。因此，加強(qiáng)稻田農(nóng)藥對(duì)克氏原螯蝦的毒性作用及安全性評(píng)價(jià)，科學(xué)指導(dǎo)稻田養(yǎng)殖的合理用藥迫在眉睫[10-12]。

百菌清(chlorothalonil，CTN)是一種高效、廣譜有機(jī)氯殺菌劑，被廣泛用于防治水稻真菌性疾病[13]，但是百菌清在土壤中經(jīng)微生物作用后轉(zhuǎn)化為能溶于水且具有毒性的羥基百菌清[14，15]，可引起蝦的毒性效應(yīng)。目前有關(guān)百菌清對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性鮮有報(bào)道，無(wú)法為克氏原螯蝦安全劑量提供科學(xué)指導(dǎo)，因此本試驗(yàn)研究了百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性，為稻蝦養(yǎng)殖中安全合理使用百菌清提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的克氏原螯蝦幼蝦購(gòu)于羅山某養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體長(zhǎng)5.86±0.10 ㎝，平均體重量3.66±0.15 g，暫養(yǎng)一周后，從中選擇210尾大小一致、外表健康的克氏原螯蝦進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)容器為十格的聚乙烯箱子（59 cm×38 cm×14 cm），購(gòu)買(mǎi)于信陽(yáng)一雜貨店；量筒1 L、燒杯250 ml、燒杯1000 ml、玻璃棒、定量瓶1 L、分析天平、溫度計(jì)、pH計(jì)、手套、試管刷、硬度計(jì)等由鄭州生物工程有限公司提供。

百菌清購(gòu)于江蘇南京領(lǐng)先國(guó)際化工生物科技集團(tuán)股份公司。

1.2 方法

試驗(yàn)于2020年4月15日至4月24日在信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。自來(lái)水經(jīng)過(guò)循環(huán)、過(guò)濾、增氧后用于試驗(yàn)，試驗(yàn)用水指標(biāo)為：pH值為6.8～7.3，堿度為1.53 mmol/L；水溫為19～21 ℃；總硬度為3.3。

本試驗(yàn)采用靜水生物實(shí)驗(yàn)法[16]。反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試確定了正式試驗(yàn)中所用百菌清的濃度范圍：400 mg/L、528 mg/L、696 mg/L、919 mg/L、1213 mg/L、1600 mg/L，無(wú)藥物添加為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，10尾蝦一組，共21組。為避免蝦之間互相爭(zhēng)斗而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)格內(nèi)放蝦一尾，每個(gè)格內(nèi)加水300 mL。用藥后8 h連續(xù)觀察克氏原螯蝦對(duì)百菌清的反應(yīng)，及時(shí)撈出死蝦，每24 h記錄1次死亡率，直至96 h試驗(yàn)結(jié)束。

死蝦判定標(biāo)準(zhǔn)為：用玻璃棒輕輕觸碰克氏原螯蝦腹部，1 min內(nèi)克氏原螯蝦不做出任何反應(yīng)，判定該蝦死亡。

1.3 數(shù)據(jù)的處理

用改良寇氏法計(jì)算半致死濃度（LC50），計(jì)算公式為：

LC50=log-1[Xm-i(∑p-0.5)] （1）

其中：Xm為最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)值，i為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差，P為各組動(dòng)物的死亡率，∑p為各組動(dòng)物死亡率之和。

通過(guò)24 h LC50和48 h LC50，計(jì)算出安全濃度（SC）。計(jì)算公式為：

SC=48 h LC50×0.3×（24 h LC50×48 h LC50-1）-2（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性試驗(yàn)致死結(jié)果

不同百菌清濃度下克氏原螯蝦幼蝦死亡情況見(jiàn)表1。從結(jié)果可見(jiàn)，在相同試驗(yàn)條件下，克氏原螯幼蝦的死亡率與百菌清濃度呈正相關(guān)，濃度越大，死亡率越高，同時(shí)和暴露時(shí)間呈正相關(guān)，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，死亡率越高。

2.2 百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的半數(shù)致死濃度和安全濃度

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，運(yùn)用公式（1）和公式（2）計(jì)算出在不同時(shí)間段的半數(shù)致死濃度和安全濃度。結(jié)果見(jiàn)表2，百菌清的24 h、48 h、72 h、96 h 的LC50分別為1939.3 mg/L、1256.8 mg/L、898.2 mg/L、823.2 mg/L；安全濃度為158.4 mg/L。

2.3 克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性反應(yīng)

開(kāi)始中毒時(shí)，克氏原螯蝦幼蝦的運(yùn)動(dòng)稍頻繁急躁，身體泛白，后期身體蜷縮活動(dòng)減少，直到最后掙扎死亡，死亡時(shí)有的側(cè)臥或仰臥于箱底，有的平趴著身體僵硬死亡。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的8 h內(nèi)，百菌清濃度為400 mg/L、528 mg/L的實(shí)驗(yàn)組中幼蝦活動(dòng)與對(duì)照組一樣正常；濃度1600 mg/L實(shí)驗(yàn)組中開(kāi)始出現(xiàn)中毒反應(yīng)，身體蜷縮泛白，24 h內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)個(gè)別活動(dòng)劇烈、急躁掙扎死亡；其他濃度試驗(yàn)組隨時(shí)間增加出現(xiàn)不同程度中毒狀況，死亡率升高。百菌清濃度400 mg/L和528 mg/L實(shí)驗(yàn)組中最后存活個(gè)體活動(dòng)減弱、掉肢。

3 討論

3.1 百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性強(qiáng)度

百菌清對(duì)克氏原螯蝦的24 h、48 h、72 h、96 h半數(shù)致死濃度分別為1939.3 mg/L、1256.8 mg/L、898.2 mg/L和823.2 mg/L，安全濃度為158.4 mg/L。依據(jù)國(guó)家《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》GB/T 31270.21-2014（大型甲殼類生物毒性試驗(yàn)）：96 h LC50≤0.1 mg/L時(shí)為劇毒性，0.1 mg/L＜96 h LC50 ≤1 mg/L為高毒，1 mg/L＜96 h LC50 ≤10 mg/L為中毒性，96 h LC50 ＞10 mg/L為低毒性[17]。百菌清的96 h LC50為823.2mg/L，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了低毒性范圍，可以判定百菌清對(duì)幼蝦急性毒性為低毒。

3.2 百菌清在稻蝦綜合種養(yǎng)田中使用的安全性評(píng)價(jià)

百菌清是一種高效、廣譜殺菌劑，常用于防治水稻、小麥、蔬菜等作物真菌病害[13]，其作用機(jī)制是能夠與真菌細(xì)胞中的3-磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，影響酶的活力，使細(xì)胞代謝受到破壞，進(jìn)而破壞或干擾菌體的生長(zhǎng)和繁殖，達(dá)到抑菌目的[18]。百菌清對(duì)魚(yú)類及水生無(wú)脊椎動(dòng)物有劇毒[19]，可導(dǎo)致大鼠肌肉失調(diào)、呼吸加速、躁動(dòng)不安和后代生命力退化等現(xiàn)象[20]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014規(guī)定谷類作物稻谷的最大殘留限量為0.2 mg/kg[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的安全濃度為158.4 mg/L，稻田最大殘留量對(duì)克氏原螯蝦幼蝦基本無(wú)毒，理論上不會(huì)造成克氏原螯蝦的死亡。但在生產(chǎn)過(guò)程中，由于藥物推薦劑量往往不能有效防治疾病，需要兩倍三倍甚至十倍以上推薦劑量才能起到殺菌效果，經(jīng)常會(huì)有養(yǎng)殖者加大推薦劑量后會(huì)引起克氏原螯蝦的死亡。還有溫度對(duì)藥物毒性的影響很大，一般來(lái)講，藥物毒性隨溫度的升高而增強(qiáng)[22]。在高溫季節(jié)使用百菌清毒性應(yīng)該比本試驗(yàn)結(jié)果毒性要高，因此在高溫季節(jié)使用一定要合理控制用量，科學(xué)用藥。

噴灑藥物時(shí)應(yīng)向上噴著在植株上，盡量避免噴液滴漏，特別在淺水區(qū)更應(yīng)該注意。噴藥前可將蝦驅(qū)趕至蝦溝中，可避免直接接觸藥物。注意及時(shí)觀察蝦的活動(dòng)情況，適當(dāng)加注新水。在噴撒農(nóng)藥進(jìn)行治療后，應(yīng)及時(shí)換水，避免過(guò)多藥物殘留，在噴藥前也可適當(dāng)往稻田加水5 cm～10 cm，施藥過(guò)后再適當(dāng)換水，以減少百菌清對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的毒性。也可對(duì)稻蝦綜合種養(yǎng)稻田分段用藥，在稻田的一段施藥，過(guò)一段時(shí)間在另一段施藥，讓蝦有安全的躲藏空間。