半定量RT-PCR 方法檢測(cè)Gch2 基因在草金魚皮膚中的表達(dá)

馮 彩， 胡 菊， 李俊茹， 崔長(zhǎng)海， 王良炎

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 河南新鄉(xiāng)453007）

體色是魚類的重要表型性狀之一，由魚類皮膚及鱗片中色素細(xì)胞的種類、數(shù)量和分布情況決定[1-2]。色素細(xì)胞由外胚層神經(jīng)嵴細(xì)胞分化形成，在胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)嵴細(xì)胞沿背腹軸分化成包括色素細(xì)胞在內(nèi)的不同類型細(xì)胞[3]。色素細(xì)胞種類不同，所含有的色素顆粒存在較大差異。黑色素細(xì)胞具有含有黑色素的色素小體，紅色素/黃色素細(xì)胞具有包含類胡蘿卜素、喋啶成分的紅/黃色素小體。虹彩細(xì)胞合成含有嘧啶成分的色素小體[4-6]。喋啶代謝通路調(diào)控喋啶色素合成，Gch2是喋啶合成通路的重要限速酶。在斑馬魚（Danio rerio）和花鳉（Poecilia reticulata）等魚類中，喋啶代謝通路是調(diào)控體色變化的一條重要代謝通路，其終產(chǎn)物為黃色和微紅的喋啶色素。這些色素是以GTP為底物經(jīng)過該通路轉(zhuǎn)化而來(lái)。該通路由3個(gè)步驟組成：（1）三磷酸鳥苷（GTP）在GTP環(huán)化水解酶及其他酶的催化下合成四氫生物蝶呤；（2）四氫生物蝶呤作為輔助因子參與喋啶通路反應(yīng)后的再生[7]；（3）黃色素、墨蝶呤及其衍生物和蝶呤的合成。Gch2是喋啶代謝通路的限速酶，對(duì)黃色素、喋啶、果蠅蝶呤等色素的合成起重要的調(diào)控作用[8]。

草金魚（Carassius auratus）屬于鯉科（Cyprinidae）、鯽屬（Carassius），是鯽（Carassius auratus）的一個(gè)變種，因體色豐富且組合形式多樣深受人們喜愛，具有十分重要的觀賞價(jià)值[9]。草金魚的體色有紅色、黑色、白色、紅白和五花等，是研究魚類乃至脊椎動(dòng)物體色變化的重要實(shí)驗(yàn)材料[9]。目前為止，所有的草金魚品系表型性狀差異主要集中在尾鰭及體表色澤上，遠(yuǎn)不及其他觀賞魚如金魚、錦鯉的種類豐富，且具有較高觀賞價(jià)值的草金魚個(gè)體較少[10]。因此，研究其體色發(fā)生和形成機(jī)理，是草金魚遺傳育種中亟待解決的問題。本文旨在通過半定量PCR分析Gch2 mRNA在純紅、純白和黑黃體色草金魚皮膚中的表達(dá)情況，為更深入理解Gch2基因在草金魚體色形成中的作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)材料取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，均為2齡草金魚，選擇純色的紅色、白色草金魚的皮膚，黑黃色草金魚的黃色皮膚和黑色皮膚進(jìn)行RNA提取實(shí)驗(yàn)。

1.2 Total RNA提取及完整性檢測(cè)

按照RNAiso Plus試劑（TaKaRa公司，大連）說明書步驟分別提取不同體色草金魚皮膚的RNA。取3 μL樣品進(jìn)行非變性瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察提取的RNA的完整性。

1.3 cDNA第一鏈合成

根據(jù)前述檢測(cè)結(jié)果，取調(diào)整后達(dá)到等量的不同體色草金魚RNA，參照PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，大連）合成cDNA第一鏈。

1.4 Gch2及常用內(nèi)參基因β-actin的PCR擴(kuò)增

根據(jù)定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier3.0 軟件，設(shè)計(jì)草金魚Gch2的引物及β-actin的引物，引物序列見表1，由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

表2 半定量PCR反應(yīng)體系Tab.2 The reaction system of Semi-QRT-PCR

采用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，紫外燈觀察照相。β-actin的PCR擴(kuò)增體系同表2。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

提取的不同體色草金魚皮膚的RNA經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)（圖1），可觀測(cè)到清晰的28s和18s條帶，28s rRNA條帶基本為18s rRNA條帶亮度的2倍，表明提取的RNA完整性良好，無(wú)降解，可以用于本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究。

用ND-2000核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度和OD值，一般以1.8＜A260/A280(Ratio，R)＜2.0為標(biāo)準(zhǔn)，表明所提RNA質(zhì)量符合要求，將合格RNA暫存于-80 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為1 μg，從而保證反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達(dá)到良好的平行性，以此確保半定量PCR實(shí)驗(yàn)的一致性，提高半定量結(jié)果的可靠性。

反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為3 ug，通過調(diào)整起始RNA的量，以等量的Total RNA反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達(dá)到良好的平行性，以此確保半定量PCR實(shí)驗(yàn)的一致性，提高半定量結(jié)果的可靠性。

2.2 Gch2基因在不同體色草金魚皮膚的表達(dá)

不同體色草金魚皮膚中Gch2的表達(dá)情況如圖2。Gch2在紅色、白色、黑黃色草金魚的皮膚中均有表達(dá)。其中黑黃色草金魚的黃色皮膚中Gch2的表達(dá)量最高，在紅色草金魚的皮膚中Gch2的表達(dá)略高于白色草金魚，在黑黃色草金魚黑色皮膚中Gch2表達(dá)量最低。重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，β-actin擴(kuò)增條帶在各樣本表達(dá)比較均一，表明該P(yáng)CR體系符合表達(dá)分析的要求。用軟件Imagej Software對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析也得到了相同的結(jié)果，見圖3。

3 討論

魚類色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴的色素母細(xì)胞，由色素母細(xì)胞再分化成6種色素細(xì)胞，分別為黑、紅、黃、白、藍(lán)色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞[8]。當(dāng)前階段對(duì)黑色素細(xì)胞的分化、形成和黑色素合成等分子調(diào)控通路的研究較為清晰而對(duì)其他色素細(xì)胞的色素顆粒代謝調(diào)控研究較少[9-10]。黃色素細(xì)胞可以合成紅/黃碟啶色素小體，在魚類體色形成中具有重要作用，是僅次于黑色素細(xì)胞的重要研究對(duì)象。因此，黃色素細(xì)胞代謝通路的研究對(duì)認(rèn)識(shí)魚類體色的形成具有重要的理論意義。

喋啶代謝通路的最終產(chǎn)物為四氫生物蝶呤（BH4），BH4是多個(gè)代謝酶的輔助因子，在組織和細(xì)胞中均有表達(dá)[11-14]。因?yàn)镚ch2是BH4從頭合成路徑和反向補(bǔ)救合成路徑的關(guān)鍵催化酶，所以在斑馬魚和比目魚中可以作為黃色素細(xì)胞的標(biāo)記基因[15]。目前，Gch2在經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值高的草金魚中還沒有相關(guān)研究。

鑒于草金魚有多種體色模式，本研究選擇常見的純紅、純白、黑黃體色草金魚作為研究對(duì)象。其中紅色和黑黃色草金魚所具有的色素細(xì)胞主要包含紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞。而紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞的色素顆粒主要為含有不同顏色的蝶啶體和類胡蘿卜素小胞，從而使魚體看起來(lái)呈橙色、黃色和紅色[16]。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gch2在純紅和黑黃色草金魚黃色皮膚中的表達(dá)量相對(duì)較高。Gch2作為喋啶代謝通路的限速酶，其高表達(dá)將促使喋啶代謝通路活躍，喋啶色素合成量增加。純白體色草金魚皮膚中Gch2的表達(dá)量與純紅體色草金魚的表達(dá)量相比偏低，這一結(jié)果同斑馬魚的研究結(jié)果近乎一致[17]。這可能是因?yàn)榘咨萁痿~的色素細(xì)胞主要包含白色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞[18]，相較于紅/黃色素細(xì)胞，白色組織的虹彩細(xì)胞可合成一部分無(wú)色的喋啶顆粒，但主要以嘌呤成分為主[19]。Gch2在黑黃色草金魚的黑色皮膚中表達(dá)量最低，推測(cè)主要因?yàn)楹谏萁痿~的色素細(xì)胞為黑色素細(xì)胞，黑色素細(xì)胞中的細(xì)胞器是由黑色素小體合成的，喋啶成分含量較少[20]。本研究初步揭示了Gch2基因在不同體色草金魚皮膚中mRNA水平表達(dá)情況，旨在為深入探究Gch2在魚類體色形成中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。