基因組編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

潘志文，高潔兒，陳偉庭，周 峰，姚 涓，姜大剛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

基因組編輯技術(shù)也稱為基因編輯或基因組工程，是指利用人工構(gòu)建的特異性核酸酶對(duì)生物體核酸序列進(jìn)行堿基替換、敲除和插入，對(duì)靶基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。在基因編輯過程中利用人工構(gòu)建的序列特異性核酸酶，通過在生物體基因組(基因)特定位置(靶位點(diǎn))制造DNA雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)，進(jìn)而利用生物體自身的同源重組(Homologous recombination，HR)或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)機(jī)制對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因組的定向編輯[1]。

在基因組編輯技術(shù)出現(xiàn)前，對(duì)基因功能的研究主要通過自然突變、物理或化學(xué)誘變、T-DNA隨機(jī)插入等方式獲得突變體，通過對(duì)突變體的研究獲得突變基因。這一過程耗時(shí)、費(fèi)力，隨機(jī)性大，效率較低，無法實(shí)現(xiàn)定向?qū)Χc(diǎn)基因的精確位置進(jìn)行修改?；蚪M編輯技術(shù)可定向敲除、修改生物體內(nèi)的某個(gè)基因，或向生物體內(nèi)定向插入某個(gè)基因(片段)，使生物體獲得新的遺傳性狀。近年來，基因組編輯技術(shù)在基因功能研究、動(dòng)植物育種、疾病治療等方面取得重要研究進(jìn)展，在全球掀起了研究熱潮[2]。筆者等綜述了基因組編輯技術(shù)的類型及其在植物中的應(yīng)用，以期為后續(xù)相應(yīng)研究提供參考。

1 基因組編輯技術(shù)的類型

目前基因組編輯技術(shù)主要利用鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)[3]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)[4]及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)與關(guān)聯(lián)蛋白(Cluster regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，CRISPR/Cas)系統(tǒng)[5]3種序列特異性核酸內(nèi)切酶(Sequence specific nuclease，SSN)實(shí)現(xiàn)。

1.1 鋅指核酸酶

ZFNs是一類包含人工設(shè)計(jì)、具有特異性識(shí)別指定DNA序列功能的鋅指DNA結(jié)合域與非特異性的Fok I DNA切割域組成的人工核酸酶。鋅指DNA結(jié)合域能特異性識(shí)別一段9～12 bp的堿基序列(靶序列)并與之結(jié)合，包含一系列串聯(lián)的具有Cys2-His2結(jié)構(gòu)、能識(shí)別并結(jié)合特定的堿基三聯(lián)體的鋅指蛋白。ZFNs技術(shù)需要針對(duì)靶位點(diǎn)兩端的雙鏈DNA序列各設(shè)計(jì)1個(gè)ZFN，2個(gè)ZFN的特異性DNA結(jié)合域會(huì)結(jié)合到靶位點(diǎn)，當(dāng)2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)間距為6～8 bp時(shí)，2個(gè)Fok I DNA切割域結(jié)合形成二聚體，對(duì)靶位點(diǎn)兩端的雙鏈DNA進(jìn)行酶切，制造DSB，進(jìn)而利用HR或NHEJ對(duì)基因組進(jìn)行修飾[3]。

1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶

TALENs是一類人工核酸酶，包含具有識(shí)別指定DNA序列功能的中央結(jié)構(gòu)域、具有Fok I核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域和具有核定位信號(hào)的N端結(jié)構(gòu)域。中央結(jié)構(gòu)域通常包含13～28個(gè)類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(Transcription activator-like effector，TALE)單元，可以識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，1個(gè)TALE單元通常由34個(gè)氨基酸組成，每個(gè)TALE單元的第12位和第13位氨基酸為重復(fù)可變雙殘基(Repeat variant diresidue，RVD)，是變化的并可以結(jié)合對(duì)應(yīng)的1個(gè)DNA堿基，其余氨基酸序列高度保守，不同的RVD可以使TALE識(shí)別1種或多種DNA堿基。N端結(jié)構(gòu)域主要是幫助TALENs定位于細(xì)胞核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用；C端結(jié)構(gòu)域主要是核酸內(nèi)切酶Fok I。TALENs與ZFNs類似，同樣需要針對(duì)靶位點(diǎn)左右兩端的雙鏈DNA序列各設(shè)計(jì)1個(gè)TALEN，2個(gè)TALEN的中央結(jié)構(gòu)域會(huì)結(jié)合到靶位點(diǎn)兩端，2個(gè)C端結(jié)構(gòu)域的Fok I結(jié)合形成二聚體，對(duì)靶位點(diǎn)兩端的雙鏈DNA進(jìn)行酶切，制造DSB，進(jìn)而利用HR或NHEJ對(duì)基因組進(jìn)行修飾[4]。

1.3 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)與關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)

CRISPR/Cas是原核生物中廣泛存在的識(shí)別入侵的外源核酸序列并對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性破壞的一套抗病毒的系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)通常由CRISPR基因座和Cas基因2部分組成，依功能元件可分為2大類5小型(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型)[6-7]，目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9屬于第2類Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)[8]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最先由CRISPR RNAs(crRNAs)、反式作用crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)和Cas9蛋白3種元件組成，后經(jīng)改造，crRNA和tracrRNA融合形成具有特異性識(shí)別靶位點(diǎn)功能的向?qū)NA(Small-guide RNA，sgRNA)，與具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白組成CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Cas9蛋白具有2個(gè)酶切活性結(jié)構(gòu)域，即HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和Ruv-C-Like核酸酶結(jié)構(gòu)域，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)的堿基序列，Ruv-C-Like核酸酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)的反義鏈。sgRNA包含長(zhǎng)度為20 bp的RNA序列，與目的DNA序列互補(bǔ)，負(fù)責(zé)識(shí)別帶有前間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motifs，PAM)的靶DNA序列，引導(dǎo)Cas9蛋白的2個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)Π形稽c(diǎn)雙鏈進(jìn)行切割，制造DSB，進(jìn)而利用HR或NHEJ對(duì)基因組進(jìn)行修復(fù)[9-10]。

CRISPR/Cas9技術(shù)由于人工sgRNA構(gòu)建方便，僅靠sgRNA就可以完成對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別，因此效率更高，切割位點(diǎn)更精確[10]。早期的CRISPR/Cas9技術(shù)存在一定的脫靶率，近年來，研究人員在對(duì)CRISPR/Cas9及其他不同CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行研究，目的是發(fā)現(xiàn)和改造出操作更簡(jiǎn)單、編輯效率更高、脫靶效應(yīng)更低的基因組編輯系統(tǒng)，如CRISPR/ Cpf1(Cas12a)系統(tǒng)。

CRISPR/Cpf1是不同于CRISPR/Cas9的第2類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)[8]：Cpf1酶比標(biāo)準(zhǔn)Cas9蛋白小，易于運(yùn)輸；Cpf1僅需1條較短的crRNA即可形成Cpf1復(fù)合物實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別與剪切；Cpf1復(fù)合物切割靶位點(diǎn)雙鏈形成的DSB位點(diǎn)是偏移的，形成“短懸端”(Overhang)，不同于Cas9復(fù)合物切割靶位點(diǎn)雙鏈的同一位置形成“平端”(Blunt ends)，更準(zhǔn)確高效地整合DNA片段；Cpf1制造的DSB位點(diǎn)遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)，若切割位點(diǎn)靶基因序列發(fā)生突變，允許切割位點(diǎn)再度進(jìn)行切割，校正基因編輯；Cpf1識(shí)別的PAM序列與Cas9不同，為2～3個(gè)T堿基，大大擴(kuò)展了PAM序列和基因組編輯的識(shí)別位點(diǎn)范圍；Cpf1能切割DNA與RNA，Cas9只能切割DNA[11-12]。

1.4 3種序列特異性核酸內(nèi)切酶應(yīng)用效果對(duì)比

ZFNs是最早被廣泛應(yīng)用的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，但設(shè)計(jì)依賴于目標(biāo)序列，不能識(shí)別任意靶DNA，結(jié)合域構(gòu)建繁瑣、難度大、時(shí)間長(zhǎng)、脫靶率高、應(yīng)用受到限制。TALENs是目前商業(yè)化應(yīng)用比較成功的基因組編輯技術(shù)，其識(shí)別區(qū)域可以設(shè)計(jì)成不同長(zhǎng)度、識(shí)別任意DNA序列的模塊化蛋白，較ZFNs具有更好的靈活性、特異性高、脫靶效應(yīng)低，但TALENs模塊的設(shè)計(jì)組裝和篩選過程比較復(fù)雜，需大量測(cè)序工作，可操作性不高。ZFNs和TALENs技術(shù)都是依賴于DNA結(jié)合蛋白模塊，而CRISPR/Cas系統(tǒng)僅靠人工合成的sgRNA就可完成對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別，設(shè)計(jì)使用簡(jiǎn)單，成本較低，已逐步發(fā)展成基因組編輯方面的主流技術(shù)[13]。

2 CRISPR技術(shù)在植物中的研究及應(yīng)用

2.1 在植物基因組編輯技術(shù)中的研究

由于CRISPR/Cas技術(shù)能大大減少植物基因組改變帶來的非預(yù)期效應(yīng)，其突變效率、精確度及安全性更高，耗費(fèi)時(shí)間更少，發(fā)展應(yīng)用前景巨大。我國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)CRISPR在植物基因組編輯技術(shù)研究方面取得了迅猛的發(fā)展，在玉米、水稻、大豆、小麥、油菜等作物的基因功能研究中得到成功應(yīng)用。

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所在植物基因組編輯技術(shù)與分子育種等方面取得重要成果。ZHANG等[14]建立了小麥CRISPR/Cas9瞬時(shí)表達(dá)的基因組編輯體系，通過CRISPR/Cas9對(duì)六倍體及四倍體小麥的7個(gè)不同基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，獲得不含外源基因且其他32個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)均未發(fā)生脫靶效應(yīng)的T0代小麥純合敲除突變體，證明建立的多倍體小麥CRISPR/Cas9體系具有更高的特異性。LIANG等[15]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，開發(fā)出將體外轉(zhuǎn)錄體(In vitro transcripts，IVTs)和核糖核酸復(fù)合物(Ribonucleoprotein，RNPs)導(dǎo)入小麥幼胚的基因組編輯體系，應(yīng)用該方法只需要9～11周即可獲得不含外源DNA的靶向修飾T0代小麥突變體。ZONG等[16]利用Cas9突變體(nCas9-D10A)融合人類胞嘧啶脫氨酶(APOBEC 3A，A3A)和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(Uracil glycosylase inhibitor，UGI)，成功構(gòu)建不受GC序列影響具有更高編輯活性的單堿基編輯系統(tǒng)A3A-PBE，在小麥、水稻及馬鈴薯中實(shí)現(xiàn)高效的C-T單堿基編輯。

中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院ZHANG等[17]構(gòu)建的新型多重CRISPR/Cas9平臺(tái)，采用三重克隆的方法把6個(gè)擬南芥靶位點(diǎn)的sgRNA克隆到一個(gè)雙元載體中，并在擬南芥中得到共表達(dá)，在擬南芥中實(shí)現(xiàn)快捷高效地編輯多個(gè)目的基因。WANG等[18]在水稻中利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)開發(fā)出簡(jiǎn)單高效的多基因位點(diǎn)編輯系統(tǒng)，效率達(dá)40%以上，同時(shí)該系統(tǒng)比CRISPR/Cas9系統(tǒng)更簡(jiǎn)便。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在植物基因組編輯技術(shù)利用方面取得了重要進(jìn)展。XIE等[19]開發(fā)了高效、簡(jiǎn)便的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并推出了在線基因組編輯工具軟件CRISPR-GE；針對(duì)獲得的基因編輯后代的測(cè)序，開發(fā)了在線軟件“簡(jiǎn)并序列解碼”(Degenerate Sequence Decoding，DSDecode)，其對(duì)利用TALENs和CRISPR技術(shù)進(jìn)行植物基因組編輯的雙等位基因突變體后代的基因分型非常方便[20-21]；ZHU等[22]開發(fā)了基于CRISPR系統(tǒng)的多基因載體系統(tǒng)(TransGene Stacking II，TGS II)，用于多基因高效快速組裝及同時(shí)轉(zhuǎn)化植物。劉耀光研究員團(tuán)隊(duì)利用TALENs和CRISPR系統(tǒng)改良基因組編輯的步驟，為植物多基因轉(zhuǎn)化、復(fù)雜代謝途徑的基因表達(dá)調(diào)控、復(fù)雜性狀的遺傳改良與植物分子育種等提供了高效的技術(shù)平臺(tái)[8]。

2.2 在植物育種中的應(yīng)用

由于CRISPR/Cas技術(shù)在植物基因組編輯技術(shù)方面取得了迅猛的發(fā)展，目前已經(jīng)在油菜、蘑菇、玉米、水稻等的育種中得到成功應(yīng)用。

Cibus公司研發(fā)了快速性狀選育系統(tǒng)(Rapid Trait Development System，RTDSTM)專利技術(shù)，成功獲得了耐磺酰脲類除草劑的基因組編輯油菜SU CanolaTM，由于SU油菜不含外源基因，已被美國(guó)和加拿大政府批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用[23]，是全球第一個(gè)商品化的基因組編輯作物，且SU油菜及配套的除雜草產(chǎn)品受美國(guó)種植者的歡迎。蘑菇在采摘后，極易發(fā)生褐變，影響質(zhì)量；而且蘑菇對(duì)磕碰極為敏感，揀貨和包裝過程中的磕碰加速蘑菇腐爛。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)雙孢菇(Agaricusbisporus)中一類編碼導(dǎo)致褐變的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)基因家族進(jìn)行基因組編輯，刪除蘑菇基因組中一個(gè)基因的幾個(gè)堿基，將這類酶的活性降低了30%，使雙孢菇獲得了抗褐變的能力，由于獲得的蘑菇不含有來源于病毒細(xì)菌等的外源DNA，美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture，USDA)豁免了對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因方面的監(jiān)管[24]，也預(yù)示著未來將有更多基因組編輯植物產(chǎn)品在接受評(píng)估之后走向人們的餐桌。

杜邦先鋒公司的研究人員對(duì)玉米ARGOS8基因(一個(gè)乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子)的表達(dá)進(jìn)行研究，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)ARGOS8基因進(jìn)行編輯，獲得抗旱高產(chǎn)的基因編輯玉米[25]。美國(guó)科迪華農(nóng)業(yè)技術(shù)公司利用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得Waxy基因缺失的高產(chǎn)糯玉米品種，且美國(guó)、阿根廷、巴西、智利已經(jīng)允許此項(xiàng)糯玉米商業(yè)化生產(chǎn)，確定不對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管[26]。

雜交水稻為我國(guó)的糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)，其中兩系雜交水稻占約1/3的種植面積。但是，兩系雜交水稻中溫敏不育系的培育，需要依靠傳統(tǒng)的雜交和回交方法在不同的光、溫條件下進(jìn)行篩選，花費(fèi)大量的人力物力和較長(zhǎng)的周期。ZHOU等[27]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)我國(guó)最廣泛使用的溫敏不育基因TMS5進(jìn)行定點(diǎn)突變，培育不帶轉(zhuǎn)基因成分的實(shí)用型溫敏不育系，獲得了11個(gè)新的不含有轉(zhuǎn)基因成分的溫敏核雄性不育系，用于快速培育具有商業(yè)化應(yīng)用價(jià)值的兩系溫敏水稻不育系，對(duì)雜交水稻育種具有重要影響。

鎘(Cd)是人體非必需元素，隨工業(yè)化進(jìn)程的加速，土壤和水體受到鎘污染后，可在植物中富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體引起中毒。TANG等[28]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除水稻中的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsNramp5，開發(fā)出低鎘積累秈稻新品系，為開發(fā)低鎘污染、安全的秈稻品種提供了一種實(shí)用的方法，最大限度地降低糧食中鎘的污染風(fēng)險(xiǎn)，通過基因組編輯技術(shù)，減少作物對(duì)于有害物質(zhì)的吸收，確保作物不受有害物質(zhì)污染，意義重大。綜上，基因組編輯技術(shù)在植物應(yīng)用對(duì)于造福人類具有巨大的應(yīng)用前景。

3 展望

以CRISPR/Cas技術(shù)為代表的基因組編輯技術(shù)日益發(fā)展，在植物基因功能研究、遺傳育種等方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要手段。由于基因組編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)，基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用仍受一定限制。CRISPR/Cas技術(shù)的出現(xiàn)，使得基因組編輯技術(shù)的發(fā)展迅速。由于組成CRISPR/Cas的元件構(gòu)成簡(jiǎn)單，僅由Cas蛋白和sgRNA組成，因此，改良途徑也相對(duì)簡(jiǎn)單，可以通過對(duì)sgRNA靶位點(diǎn)識(shí)別序列進(jìn)行優(yōu)化和人工改造或嘗試不同的Cas蛋白等方式。目前，已有對(duì)CRISPR/Cas技術(shù)優(yōu)化改良的大量報(bào)道[8，13]。CRISPR/Cas技術(shù)由于其操作設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，加上其脫靶改良技術(shù)的不斷發(fā)展，被越來越廣泛地應(yīng)用于各種植物基因組功能研究和作物改良中。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與普及，靶位點(diǎn)的分析與選擇和編輯后代基因型分析也將變得更加方便快捷，同時(shí)，科學(xué)家們針對(duì)基因組編輯技術(shù)開發(fā)的數(shù)據(jù)分析和設(shè)計(jì)軟件系統(tǒng)(如CRISPR-GE、DSDecode等)[19-21]及針對(duì)基因組編輯轉(zhuǎn)化的多基因編輯系統(tǒng)(如TGS II)[22]、單堿基編輯系統(tǒng)(如A3A-PBE)[16]等，都大大加快基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用。此外，隨著大數(shù)據(jù)等技術(shù)的發(fā)展，靶位點(diǎn)的選擇及核酸酶的構(gòu)建會(huì)更加容易，基因組編輯技術(shù)將更精準(zhǔn)、更高效地為人類服務(wù)。