家畜黃體新生血管形成的分子機(jī)制及其意義

張正紅，劉召遠(yuǎn)，張經(jīng)偉，王正朝

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007)

在哺乳動(dòng)物中，黃體的主要作用是產(chǎn)生大量的孕酮，對(duì)妊娠的建立和維持是必不可少的。在黃體的形成和發(fā)育過(guò)程中，新生血管的形成起到了關(guān)鍵性作用，對(duì)黃體功能的維持具有重要的作用[1-2]。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，通過(guò)靶向抗體或可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受體抑制黃體VEGF，則阻斷血管形成與孕酮產(chǎn)生[3-4]。同樣在奶牛中，中和VEGF或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(Fibroblast Growth Factor-2，F(xiàn)GF-2)也可以抑制黃體的發(fā)育和孕酮的產(chǎn)生[1-3]。另外，黃體血管形成在黃體功能中的重要作用已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)基因、基因敲除和基因敲入小鼠模型得以證明，并發(fā)現(xiàn)血漿孕酮水平的降低與黃體血管化中斷和生育能力的降低密切相關(guān)，進(jìn)一步表明了黃體血管形成與黃體功能相關(guān)[1-4]。黃體的形成是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生了一系列完整的生物學(xué)事件，具有重要的生理學(xué)意義[1-7]。如牛黃體在10 d內(nèi)細(xì)胞體積增加了60～100倍，其生長(zhǎng)速率可與生長(zhǎng)最快的腫瘤相媲美，黃體組織重塑完全依賴于強(qiáng)烈的血管增生和新生血管的形成[5-7]。

1 家畜黃體新生血管形成的啟動(dòng)

1.1 排卵前卵泡的編程作用

黃體發(fā)育的結(jié)構(gòu)和功能框架是由排卵前卵泡提供的，這產(chǎn)生了黃體功能的卵泡編程作用的概念。目前，對(duì)卵泡血管化在這個(gè)編程作用中的功能還知之甚少，但卵泡內(nèi)膜層的血管化程度可能決定了隨后黃體血管化程度；同時(shí)也提出在卵泡向黃體轉(zhuǎn)變過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞形成“血管起始點(diǎn)”，這些起始點(diǎn)在血管床重建過(guò)程中為內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖建立支架[1-7]。

排卵前卵泡在黃體血管生成中的另一個(gè)可能作用是在卵泡發(fā)生過(guò)程中各種促血管生成因子的累積作用，如卵泡液中FGF-2濃度達(dá)到1 ng/mL和VEGF濃度達(dá)到2～5 ng/mL[5-7]。這些因子可能通過(guò)其肝素結(jié)合性在卵泡基膜中被隔離，并隨LH峰誘導(dǎo)蛋白酶激活[5-7]。人卵泡液可劑量依賴性地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)細(xì)胞的增殖[8]。熱失活或免疫中和FGF2/VEGF不能阻斷這種刺激作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)卵泡液誘導(dǎo)血管增生是通過(guò)1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-Phosphate，S1P)[9]。溶血磷脂酸(Lysobisphosphatidic Acids，LPA)是另一種磷脂，是由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生并在卵泡液有著更大的濃度(25 μM)[9]。另外，10 μM LPA處理的培養(yǎng)基可通過(guò)IL-6和IL-8促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移、滲透和增殖[8]；同時(shí)還證明了LPA可以增加牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及黃體細(xì)胞孕酮的產(chǎn)生[9]。

1.2 LH峰的啟動(dòng)作用

促黃體生成素(Luteinizing Hormone，LH)峰及其刺激排卵過(guò)程對(duì)大量基因的表達(dá)上調(diào)是至關(guān)重要的，其中許多基因與調(diào)控血管增生有關(guān)。事實(shí)上，內(nèi)源性LH峰的大小與發(fā)育黃體的血管化程度呈正相關(guān)，認(rèn)為L(zhǎng)H峰有黃體血管增生的啟動(dòng)作用[10-12]。例如，牛LH峰后不久卵泡FGF2 mRNA和蛋白濃度急劇增加，而VEGF的表達(dá)似乎不受LH峰的影響[5-7]。目前，尚不清楚LH峰對(duì)其他物種黃體化顆粒細(xì)胞中VEGF表達(dá)的確切影響。新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展就LH峰對(duì)卵泡轉(zhuǎn)錄組的影響作出了更詳細(xì)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多血管增生相關(guān)的基因表達(dá)都受LH峰調(diào)控，確認(rèn)了一些已知的刺激血管增生過(guò)程或內(nèi)皮細(xì)胞功能的因子(如FGF2、纖連蛋白和肌配蛋白B2)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與組織重建相關(guān)的一些基因也影響血管增生(如酸性半胱氨酸蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1)。值得關(guān)注的是，一些被認(rèn)為是抗血管增生的因子也被上調(diào)了，如穿透素3、軸突導(dǎo)向因子3A/C和血小板反應(yīng)蛋白1。排卵需要前列腺素(Prostaglandin，PG)，且環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑可以抑制排卵[5-7]。在顆粒細(xì)胞中，LH促進(jìn)PG合成，排卵前達(dá)到峰值，PGE2已經(jīng)證明至少在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中是重要的前列腺素[11-12]。越來(lái)越多的證據(jù)表明PGE2不僅對(duì)排卵至關(guān)重要，而且也是黃體血管增生的重要刺激因子。Sakurai等人研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑NS-398處理大鼠可以抑制早期黃體的血管形成，并減少孕酮的產(chǎn)生，而聯(lián)合使用PGE2可以逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)[13]。

2 促血管生成因子對(duì)黃體新生血管形成的調(diào)控

2.1 FGF2和VEGF

FGF2和VEGF是最重要的促血管生成因子，是最有力的細(xì)胞分裂劑，也可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生存。VEGF在奶牛和人的發(fā)育黃體中主要定位于類固醇細(xì)胞，抑制VEGF作用將顯著降低靈長(zhǎng)類動(dòng)物黃體的血管化和孕酮的生成[5-7,10-12]。有趣的是，F(xiàn)GF2在早期黃體中水平非常高，幾天后就會(huì)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，同時(shí)FGF2蛋白也從內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到類固醇細(xì)胞，然后再返回[14]，表明FGF2在黃體血管生成過(guò)程中具有動(dòng)力學(xué)的作用。內(nèi)皮細(xì)胞涌出的關(guān)鍵過(guò)程是在已建立的脈管系統(tǒng)內(nèi)形成一種特殊的內(nèi)皮端細(xì)胞，因此，F(xiàn)GFR信號(hào)可能對(duì)內(nèi)皮端細(xì)胞形成和血管形成至關(guān)重要。血管通透性的調(diào)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)重要功能，它對(duì)黃體組織的營(yíng)養(yǎng)/激素的供給非常重要。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞通透性的有效刺激因子，是由粘附分子(如VE-鈣粘蛋白)和緊密連接(如閉合蛋白)所調(diào)控。Herr等研究發(fā)現(xiàn)hCG可以誘導(dǎo)VEGF依賴性VE-鈣粘蛋白和閉合蛋白5表達(dá)下調(diào)，這與人顆粒-內(nèi)皮共培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加有關(guān)[15-16]。

2.2 白介素-8(IL-8)

IL-8是一種嗜中性粒細(xì)胞特異性的趨化因子和促血管生成細(xì)胞因子，在早期黃體中高度表達(dá)，與多核中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear Neutrophils，PMNs)的豐度一致。此外，培養(yǎng)早期黃體細(xì)胞的條件性培養(yǎng)基可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的PMN細(xì)胞遷移，且可以被IL-8抗體阻斷。重組牛IL-8和PMN上清可以促進(jìn)黃體內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成[17-19]。

2.3 酸性半胱氨酸蛋白(SPARC)

SPARC是一種基質(zhì)相關(guān)糖蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、遷移和細(xì)胞間的信息傳遞。重要的是，SPARC的功能通過(guò)靶向蛋白水解而發(fā)生變化，成熟的SPARC蛋白是抗血管生成因子，其水解片段是促血管生成因子[20]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)hCG誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞中SPARC mRNA上調(diào)7倍。TGF-β和纖維粘連蛋白劑量依賴性誘導(dǎo)牛黃體化顆粒細(xì)胞中SPARC的表達(dá)。此外，SPARC蛋白主要在黃體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，且SPARC水解片段可以增加內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)的形成，還可以促進(jìn)孕酮的產(chǎn)生[20]。因此，SPARC或含KGHK肽可能是治療黃體功能不足的新靶點(diǎn)。

2.4 缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)

在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，血管生成的關(guān)鍵動(dòng)力是低氧誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞缺氧激活HIF-1(Hypoxia Inducible Factor)，其與啟動(dòng)子HRE結(jié)合，啟動(dòng)缺氧調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，是由氧調(diào)控的HIF-1 和結(jié)構(gòu)表達(dá)HIF-1β組成的異二聚體[10-12]。在有腔卵泡發(fā)育的后期，卵泡液中的氧濃度下降[5-7]。在排卵后血管重構(gòu)和早期黃體發(fā)育過(guò)程中，組織氧濃度降低，導(dǎo)致HIF-1a表達(dá)[10-12]。在豬、人類、奶牛和小鼠的排卵期時(shí)，HIF-1 均被上調(diào)。此外，棘毒素是HIF-1特異性抑制劑，可以阻斷小鼠的排卵[21-22]。目前，前期的研究也已經(jīng)表明HIF-1 可以通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)參與黃體血管生成和和早期黃體發(fā)育[5-7,10-12]。

2.5 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞頂端的形成中起著重要作用。膜結(jié)合的δ樣配體4(DLL4，Delta-Like Ligand 4)在內(nèi)皮端細(xì)胞中表達(dá)，并與鄰近細(xì)胞Notch結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)楸?xì)胞[4]。DLL4和Notch1-4已經(jīng)被檢測(cè)到在小鼠黃體內(nèi)皮細(xì)胞和類固醇細(xì)胞中表達(dá)。用γ-分泌酶抑制劑處理，阻斷下游Notch信號(hào)通路，小鼠將發(fā)生排卵前卵泡發(fā)育障礙，這可能與內(nèi)皮細(xì)胞紊亂和血管平滑肌細(xì)胞密度增加的內(nèi)膜層相關(guān)。此外，血漿雌二醇的濃度幾乎降低了三倍[4]。內(nèi)皮細(xì)胞模式與高濃度FGF2誘導(dǎo)牛黃體細(xì)胞的結(jié)果相似，且用γ-分泌酶抑制劑處理可降低大鼠孕酮濃度[4,14]，表明FGF2、VEGF和Notch通路之間在早期黃體發(fā)育過(guò)程中可能存在著潛在的相互作用。

3 抗血管生成因子對(duì)黃體新生血管形成的調(diào)控

3.1 血小板反應(yīng)蛋白(THBS)

THBS-1和THBS-2是一些細(xì)胞類型分泌的大分子糖蛋白，可以與結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)(ECM，Extracellular Matrix)結(jié)合。THBS通過(guò)其受體CD36(Cluster of Differentiation 36，分化簇36)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能，如遷移、粘附和細(xì)胞凋亡。THBS-1、THBS-2和CD36在大鼠早期黃體中表達(dá)最多，F(xiàn)GF2和THBS-1對(duì)體外培養(yǎng)的牛黃體內(nèi)皮細(xì)胞有相反的作用[23-24]。此外，THBS-1可以阻礙FGF2誘導(dǎo)黃體內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，這與血小板反應(yīng)蛋白模擬肽ABT898對(duì)絨猴卵泡血管生成影響體外觀察結(jié)果是一致的，但ABT898對(duì)排卵和血漿孕酮濃度沒(méi)有影響[23-24]。

3.2 8b亞型VEGF

VEGF外顯子8可以通過(guò)不同的剪接，產(chǎn)生兩種VEGF亞型，即8a和8b。8a亞型家族具有典型的促血管生成作用，而8b亞型家族則具有抗血管生成作用[25]。這種復(fù)雜性目前還了解相當(dāng)缺乏，且絕大多數(shù)VEGF抗體不能區(qū)分這兩種不同亞型家族。8b亞型VEGF通常與8a亞型VEGF一起表達(dá)，但在綿羊黃體中8a亞型VEGF表達(dá)升高，卻沒(méi)有檢測(cè)到8b亞型VEGF。有趣的是，過(guò)表達(dá)8b亞型VEGF可以減少生育率、黃體數(shù)和黃體血管化程度[25]，進(jìn)一步表明在黃體發(fā)育過(guò)程中促血管生長(zhǎng)因子和抗血管生成生長(zhǎng)因子之間平衡的重要性。

3.3 血管抑制蛋白-1(VASH-1)

VASH-1與IGFBP-7(Insulin-like Growth Factor Binding Protein-7，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-7)是另外兩個(gè)血管生成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在牛黃體發(fā)育過(guò)程中，VASH-1在黃體內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，且通過(guò)VEGF上調(diào)[26]。VASH-1抑制VEGF誘導(dǎo)牛黃體內(nèi)皮細(xì)胞管的形成[26]，表明其可以防止血管生成的過(guò)度刺激。IGFBP-7可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、粘附和血管生成，且在大鼠卵泡液和黃體中已經(jīng)檢測(cè)到其表達(dá)[27]，IGFBP-7可以減少VEGF和LH誘導(dǎo)黃體內(nèi)皮細(xì)胞管的形成[27]。

3.4 穿透素3(PTX-3)

PTX-3是一種分子量為45 kDa的糖基化蛋白，是由內(nèi)皮細(xì)胞和激活的吞噬細(xì)胞產(chǎn)生。PTX-3與FGF-2的親和力高，可阻止FGF-2與FGFR結(jié)合，阻斷其促血管生成作用[28]。另外，在使用PGF2 后，PTX-3在成熟黃體中的表達(dá)顯著增加，表明PTX-3在黃體溶解中具有抗血管生成功能[28]。

4 其他因子對(duì)黃體新生血管形成的調(diào)控

4.1 血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VECD)

VECD是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子，可在相鄰細(xì)胞間形成粘附連接，不僅能維持血管完整性，而且還能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和VEGFR功能[29]。在血管增生過(guò)程中，Notch/VEGFR信號(hào)通路可以改變VECD連接，驅(qū)動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞重新排列[4]。 利用E4G10抗體免疫中和小鼠VECD能降低黃體發(fā)育、血管化程度和血漿孕酮濃度[29]，進(jìn)一步表明VECD對(duì)黃體血管生成的至關(guān)重要性。TGF- 處理牛黃體內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞連接處VECD丟失，減少細(xì)胞接觸，增加內(nèi)皮細(xì)胞滲透性[29]。相反，F(xiàn)GF2信號(hào)可以促進(jìn)VECD的表達(dá)和維持血管的完整性[29]。

4.2 內(nèi)皮下祖細(xì)胞(PCs)

PCs與內(nèi)皮細(xì)胞形成親密接觸，是微血管的組成部分。通常認(rèn)為PCs通過(guò)穩(wěn)定新形成的內(nèi)皮管，參與后期血管生成[30]。誘導(dǎo)PDGFR-B(Platelet-Derived Growth Factor Receptor，血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-B)的表達(dá)可以刺激PCs，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞募集。事實(shí)上，阻斷卵巢內(nèi)PDGFR將減少黃體的數(shù)量和孕酮的產(chǎn)生，同時(shí)減少微血管的內(nèi)皮細(xì)胞和PCs[30]。在發(fā)育黃體中，PCs數(shù)量豐富，并形成大量增殖細(xì)胞，支持強(qiáng)烈的黃體血管生成。

4.3 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)

IGF-1是一種內(nèi)分泌和旁分泌生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)卵泡和黃體功能方面具有重要作用。IGF-1在黃體中局部表達(dá)，且對(duì)孕酮的分泌有刺激作用，被認(rèn)為在血管增生過(guò)程中具有促血管生成的特性[30]。另外，IGF-1還可以通過(guò)穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管來(lái)促進(jìn)血管生成，這對(duì)黃體血管生成特別重要，因?yàn)樽畛踉趦?nèi)膜層的黃體血管化不穩(wěn)定[31]。目前，有關(guān)IGF-1在調(diào)節(jié)卵巢血管生成方面的作用仍知之甚少，有待進(jìn)一步深入研究。

5 臨床意義

5.1 卵巢癌

腫瘤的生長(zhǎng)和最終的轉(zhuǎn)移需要活躍的血管增生，由促血管生成因子的上調(diào)和內(nèi)源性抑制因子的下調(diào)導(dǎo)致，為治療干預(yù)提供了許多機(jī)會(huì)。晚期上皮型卵巢癌與血清VEGF水平升高有關(guān)[32]，而VEGF是迄今為止的主要治療靶點(diǎn)，使用多血管激酶抑制劑在多水平上靶向腫瘤血管生成將成為下一步目標(biāo)，如聯(lián)合抑制VEGF，F(xiàn)GF和PDGF信號(hào)[32]。另外，還在探索如何利用內(nèi)源性抑制血管生成，如改變血管形態(tài)、促進(jìn)藥物攝取和增加凋亡細(xì)胞死亡等。

5.2 卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)

OHSS是在刺激卵巢治療生育過(guò)程中的一種罕見(jiàn)但可能危及生命的并發(fā)癥，其通常發(fā)生在黃體期或早期妊娠階段，特點(diǎn)是卵巢分泌的血管活性肽(如VEGF)引起血管壁通透性的系統(tǒng)性增加[33-35]。OHSS與黃體和卵泡液體中VEGF表達(dá)和生物藥效升高有關(guān)，VEGF可以促進(jìn)血管通透性升高[33-35]。盡管VEGF在調(diào)節(jié)OHSS中具有重要的作用，但直接靶向VEGF將產(chǎn)生不良的副作用，故大多數(shù)預(yù)防性治療都是靶向自身制定刺激方案，如減少LH的持續(xù)時(shí)間[33-35]。減少OHSS的發(fā)病率和嚴(yán)重性的另一種普遍關(guān)注的臨床策略是激動(dòng)劑多巴胺作為VEGF抑制劑的使用[33]。高危女性使用多巴胺可以降低OHSS的發(fā)病率，且對(duì)輔助生殖后的著床或妊娠結(jié)果沒(méi)有不利影響[33]。

6 小 結(jié)

新生血管的形成對(duì)黃體的急劇生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要，盡管VEGF和FGF2被認(rèn)為是黃體血管生成的主要調(diào)控因子，但黃體細(xì)胞分泌的許多其他因子也具有重要的調(diào)節(jié)功能，表明黃體血管形成是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，是一個(gè)促血管生成因子和抗血管生成因子相互作用和相互協(xié)調(diào)的過(guò)程，受多種信號(hào)分子的調(diào)控。