黃連木性別鑒定研究進(jìn)展

陳嘉裔

（東南大學(xué)成賢學(xué)院，江蘇南京 210088）

黃連木屬（Pistacia）屬漆樹科（Anacardiaceae）植物，雌雄異株，全世界約10種，分布于地中海沿岸、阿富汗，亞州中部、東部和東南部，菲律賓至中美墨西哥和南美危地馬拉［1］。我國(guó)有3種，除東北和內(nèi)蒙古外均有分布［2-3］。本屬植物均具有較高的經(jīng)濟(jì)用途，如中國(guó)黃連木（Pistacia chinensis）作為生物燃料油樹種，是一種極其重要的木本能源植物［4］；阿月渾子（Pistacia vera）兼具木本油料和干果兩大功能，干果商品名為開心果，是世界四大堅(jiān)果之一［5］；清香木（Pistacia weinmannifolia）除葉可提取芳香油外，葉及樹皮還可作藥用［3］。

黃連木屬雌雄株的早期性別鑒定在科研與實(shí)踐方面都具有重大意義。首先，不同性別的植株往往具有不同的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如中國(guó)黃連木雌株因其種子可作為生物柴油的原料而具有相較雄株更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，雄株則是不可或缺的授粉樹［6-7］，兩者種植比例需要合理規(guī)劃；其次，黃連木童期一般需6～10年，時(shí)間漫長(zhǎng)，期間若不采取方法對(duì)黃連木雌雄株性別進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，將為黃連木育種改良工作帶來巨大障礙［8］。因此黃連木性別鑒定研究在其生產(chǎn)以及遺傳育種研究方面都顯得尤為重要。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)黃連木屬在自然狀態(tài)下并不僅僅只有雌株、雄株2個(gè)性別表現(xiàn)型，如中國(guó)黃連木存在雌雄同花序、大西洋黃連木（Pistacia atlantica）不同側(cè)枝性別各不相同等［9-10］，這些現(xiàn)象給黃連木性別鑒定工作帶來更多困難。但雌雄個(gè)體間的差異總還是會(huì)在某些宏觀或微觀上表現(xiàn)出來，特別是隨著近年來分子生物學(xué)等新學(xué)科新技術(shù)的不斷發(fā)展，更多植物性別鑒定的原理與方法也隨之產(chǎn)生，為傳統(tǒng)植物的性別鑒定研究工作帶來重大變革［11］。

1 黃連木性別鑒定研究進(jìn)展

1.1 基于形態(tài)差異關(guān)于雌雄異株植物性別鑒定的研究早期都是從形態(tài)學(xué)入手，因?yàn)榇菩郛愔曛参锘蛩讲煌?，植株形態(tài)也會(huì)存在或多或少的差異，由此可對(duì)植株性別進(jìn)行鑒定。例如，在對(duì)植株外部形態(tài)的研究中，馬麗媛等［13］研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)黃連木雄株葉片的葉形指數(shù)顯著小于雌株，雄株的葉形偏狹長(zhǎng)，雌株的葉形偏短寬；雄株的葉面積極顯著小于雌株；黃連木雌株的主枝分枝角度極顯著大于雄株，外觀表現(xiàn)為雄株樹冠抱攏，雌株樹冠開張。譚冬梅等［14］對(duì)阿月渾子進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)雌雄株的葉形指數(shù)也存在極顯著差異，結(jié)論與中國(guó)黃連木研究結(jié)果基本一致。而在對(duì)植株葉片的微觀研究中，王小燕［15］研究發(fā)現(xiàn)，10年生中國(guó)黃連木雌雄株葉片間氣孔密度、氣孔長(zhǎng)度與寬度并無顯著差異，僅在40年生植株中存在極顯著性差異，這說明植物形態(tài)特征不僅與基因水平上的差異有關(guān)，還可能受發(fā)育階段、外界環(huán)境等多方面的影響，因此基于外部形態(tài)差異的鑒定雖然簡(jiǎn)單直接，但并非黃連木性別鑒定的可靠依據(jù)，只能作為鑒定體系中的一部分。

1.2 基于生理生化差異在生理生化方面，雌雄株的差異主要體現(xiàn)在代謝過程中某些酶的活性差異以及其內(nèi)源激素、氨基酸、次生代謝物質(zhì)的含量不同等［16］。楊鷺生等［12］用溴麝香草酚蘭（BTB）方法，成功對(duì)中國(guó)黃連木雌雄株進(jìn)行性別鑒定。馬麗媛等［13］通過測(cè)定中國(guó)黃連木雌雄株多胺含量以及內(nèi)源激素的差異來對(duì)黃連木進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：中國(guó)黃連木雄株葉片在各生長(zhǎng)時(shí)期Spm（精胺）含量高于雌株、Put（腐胺）含量低于雌株，ABA、IAA含量均大于雌株。然而，Said等［17］通過熒光速率測(cè)量，結(jié)果表明：乳香黃連木（Pistacia lentiscus）量子產(chǎn)量和色素含量受季節(jié)影響，雌雄Fv∕Fm比值在春天顯著高于雄株，而夏天雄株高于雌株。王小燕［15］對(duì)10年、40年樹齡不同生長(zhǎng)時(shí)期的中國(guó)黃連木雌雄株生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：2種樹齡的中國(guó)黃連木雌雄株葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量，10年生雌雄株間差異達(dá)到顯著水平，40年生則無明顯差異。由此可見，基于生理生化的性別鑒定也并非完全可靠，環(huán)境因素以及植物自身發(fā)育狀況等都會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生干擾。

1.3 基于同工酶圖譜植物的性別主要受基因調(diào)控，而同工酶是分子水平的指標(biāo)，是基因差異在表達(dá)水平的體現(xiàn)，具有組織、發(fā)育及物種的特異性，是植物性別鑒定的有效途徑之一［18］。目前，對(duì)同工酶的研究主要有酯酶（EST）、過氧化物酶（POD）以及多酚氧化酶（PPO），其中大多數(shù)集中在對(duì)雌雄器官中POD的研究。程世平［19］發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃連木雌雄株在過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）和多酚氧化酶（PPO）3種同工酶的酶譜上都存在明顯差異。李國(guó)平等［20］通過對(duì)中國(guó)黃連木雌雄株發(fā)育不同階段的葉片中PPO和POD相對(duì)活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PPO、POD相對(duì)活性在雌雄株間存在顯著差異，在老葉中則存在極顯著差異。以雌雄個(gè)體間存在的顯著特征譜帶差異來對(duì)黃連木進(jìn)行雌雄鑒別，方法較簡(jiǎn)單，可用于實(shí)驗(yàn)室黃連木的研究，但這一技術(shù)依然受限于同工酶組織特異性、發(fā)育階段以及生境等方面的影響，還需進(jìn)一步完善其可靠性［21］。

1.4 基于特異蛋白差異近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不斷深入，這對(duì)于雌雄異株植物的性別鑒定工作具有很大幫助［22-24］。Xiong等［25］利用蛋白質(zhì)組學(xué)中的雙向電泳技術(shù)對(duì)中國(guó)黃連木雌雄株的葉片和莖段進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，成功鑒定出其中7個(gè)；研究還發(fā)現(xiàn)，性別相關(guān)的蛋白質(zhì)具有不同的組織特異性，在枝條中這種差異更為明顯：如溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在雄株枝條的木質(zhì)部和韌皮部顯著表達(dá)遠(yuǎn)高于雌株，而雄株枝條的韌皮部中沒有表達(dá)磷酸甘油酸激酶蛋白，在雌株卻高豐度表達(dá)。這些研究結(jié)果不僅表明通過蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)可有效對(duì)黃連木進(jìn)行性別鑒定，同時(shí)也為進(jìn)一步研究黃連木性別差異的生化機(jī)制提供了可能。

1.5 基于分子標(biāo)記DNA分子間的差異及基因的表達(dá)差異是導(dǎo)致植物性別差異的主要原因，目前在黃連木的性別鑒定中，已用到的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要有RAPD、SCAR和SNP。

1.5.1 基于隨機(jī)引物PCR的RAPD分子標(biāo)記技術(shù) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）［26，27］是以一寡聚核苷酸序列（4～20bp）為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有相對(duì)易操作、省時(shí)省力、多態(tài)性好等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注［28］。Hormaza等［29］利用700對(duì)RAPD隨機(jī)引物對(duì)阿月渾子進(jìn)行研究，結(jié)果顯示引物（opo08945）在945pb處發(fā)現(xiàn)雄株有特異帶，這一標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)對(duì)阿月渾子性別鑒定具有重要意義。KAFKAS等［30］對(duì)大西洋黃連木472對(duì)隨機(jī)多態(tài)引物RAPD，篩選出2對(duì)和大西洋黃連木性別相關(guān)的標(biāo)記引物BC156和BC360，其中BC360（500bp）可能與雌性性別決定位點(diǎn)相關(guān)。由此可見，RAPD技術(shù)的特異引物對(duì)黃連木屬其他植物的性別鑒定是無效的，且RAPD仍然存在著一些不足：如要經(jīng)歷繁瑣的引物篩選過程、對(duì)試驗(yàn)條件較敏感、試驗(yàn)重復(fù)性差等，目前僅在引物初篩過程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1.5.2 基于序列特征化擴(kuò)增區(qū)域的SCAR分子標(biāo)記技術(shù)SCAR分子標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)，利用RAPD、AFLP等技術(shù)找到與目的性狀相連鎖的標(biāo)記后發(fā)展而來的，在原來10個(gè)堿基的引物基礎(chǔ)上增加合成上述末端序列約14個(gè)堿基構(gòu)成，具有已知序列、標(biāo)記共顯性、簡(jiǎn)單易用、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在植物分子育種中應(yīng)用廣泛［31，32］。Yakubov 等［33］將RAPD轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記來鑒定阿月渾子，發(fā)現(xiàn)在909pb和905pb片段，雌雄株分別具有較高的同源性（95%）；基于此片段設(shè)計(jì)了新的SCAR引物多態(tài)位點(diǎn)，在297bp片段處能很好地區(qū)分雌雄。Esfandiyari等［34］將DNA 的RAPD 標(biāo)記基因?qū)隨CAR 區(qū)以大規(guī)模篩選野生黃連木雌雄種，開發(fā)了與黃連木性別相關(guān)的1 個(gè)300bp 的SCAR 標(biāo)記（BC1200），該標(biāo)記只存在于研究的所有雌性個(gè)體，而不存在于雄性個(gè)體。Sun等［35］也通過ISSR技術(shù)找到2個(gè)與中國(guó)黃連木雌株基因位點(diǎn)相連鎖的標(biāo)記S1和S281，并成功開發(fā)出一個(gè)為636pb的SCAR標(biāo)記（FS281）片段。程世平［19］通過對(duì)200條RAPD隨機(jī)引物的篩選，篩選出可在雌雄株基因池間擴(kuò)增出差異條帶的6條引物，并成功開發(fā)了與雌株相關(guān)的550bp的SCAR引物S1420-11C，可對(duì)中國(guó)黃連木的性別進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。這些研究結(jié)果表明SCAR標(biāo)記對(duì)黃連木屬的植株標(biāo)記并不通用，Kafkas等［36］對(duì)大量阿月渾子和野生黃連木種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果也表明有遺漏的雌株和誤報(bào)的雄株個(gè)體。

1.5.3 基于DNA芯片技術(shù)的SNP分子標(biāo)記技術(shù) 單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間只有1個(gè)核苷酸的差異或只有小的插入、缺失。SNP是一種多態(tài)性較高的雙等位型標(biāo)記，是一種應(yīng)用前景廣闊的遺傳標(biāo)記物［37］。Kafkas等［36］以阿月渾子9個(gè)雌株和9個(gè)雄株為材料，利用Hi-Seq2000進(jìn)行測(cè)序（Illumina），通過RAD開發(fā)出33757個(gè)SNP標(biāo)記，確定了38對(duì)候選連鎖標(biāo)記，通過檢測(cè)并設(shè)計(jì)SNP引物，其中8對(duì)能準(zhǔn)確區(qū)分阿月渾子性別后代，并在大量黃連木屬植物中得以驗(yàn)證。SNP技術(shù)具有基因定位功能，能準(zhǔn)確區(qū)分顯性和共顯性基因位點(diǎn)，使得追溯基因源成為可能。同時(shí)，基于SNP 的高度多態(tài)性也為黃連木屬其他植株的鑒定提供一種新的手段。

2 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，基于外部形態(tài)、生理生化的2種方法相對(duì)簡(jiǎn)單易行，都為黃連木性別鑒定研究提供了事實(shí)依據(jù)，但不夠準(zhǔn)確，容易受環(huán)境影響，利用價(jià)值不高；利用同工酶、特異蛋白、分子標(biāo)記等技術(shù)的鑒別結(jié)果雖然相對(duì)可靠，但這些鑒定技術(shù)所需儀器和環(huán)境要求普遍較高，同時(shí)存在操作繁瑣、鑒定價(jià)格昂貴等問題，在實(shí)際生產(chǎn)中也難以推廣運(yùn)用。植物性別決定機(jī)制主要由遺傳因子和環(huán)境因素決定，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展，綜合利用各種性別鑒定技術(shù)，逐步了解控制黃連木性別遺傳的機(jī)理，黃連木早期性別鑒定難題將會(huì)得到解決。