動物脂代謝細(xì)胞模型研究進(jìn)展

趙海東，鄔明麗，王淑輝，孫秀柱，2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

長期以來，脂肪一直都被視為一種能量貯存組織，隨著研究的不斷深入，其作為一種重要的內(nèi)分泌器官和免疫器官也逐漸被眾多研究者證實[1-2]。目前針對人類脂肪代謝的研究漸趨深入，同時針對肉類食品的低脂化相關(guān)研究也正逐步增多，因此建立體外脂肪細(xì)胞模型成為脂肪代謝研究的重要基礎(chǔ)。脂肪細(xì)胞模型建立過程中存在物種、年齡、組織部位、培養(yǎng)方式等差異，造成脂肪細(xì)胞模型建立成功率低、難度大、實驗研究可重復(fù)性差等問題。本文擬通過對不同動物脂肪細(xì)胞模型建立過程中的方法進(jìn)行綜述，并結(jié)合本實驗室脂肪細(xì)胞模型建立經(jīng)驗，梳理出在不同物種當(dāng)中建立脂肪細(xì)胞模型的可行方案，并對這些細(xì)胞模型的生物學(xué)差異性進(jìn)行比較，為脂代謝相關(guān)研究提供更為合適的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)方案，為脂代謝細(xì)胞模型生物學(xué)差異研究提供一定的參考依據(jù)。

目前體外脂代謝研究通常采用細(xì)胞系和原代脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。脂肪細(xì)胞系可劃分為3類，以C3H10T1/2和NIH3T3為代表的干細(xì)胞類型細(xì)胞系，以3T3-L1和3T3-F422A為代表的白色脂肪來源前脂肪細(xì)胞系和以PZA6為代表的棕色脂肪來源的前脂肪細(xì)胞系。原代培養(yǎng)按照物種可分為模式動物脂肪細(xì)胞模型和家養(yǎng)動物細(xì)胞模型；按細(xì)胞組織代謝類型可分為白色、棕色和米色脂肪細(xì)胞模型。前脂肪細(xì)胞系在用于脂代謝相關(guān)研究中不能體現(xiàn)出年齡、性別等差異。因此原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)是脂代謝研究的一個重要環(huán)節(jié)，將為脂代謝研究的不斷深入提供有力的研究模型。

1 脂肪細(xì)胞模型分類

1.1 多潛能干細(xì)胞類型脂肪細(xì)胞系

C3H10T1/2是小鼠未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，除成脂分化以外，還可通過不同方式誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等[3-4]。NIH3T3是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系，具有誘導(dǎo)成脂分化能力和較高的轉(zhuǎn)染效率，多用于基因表達(dá)相關(guān)研究[5]。二者為不定向的(non-committed)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)基因表達(dá)C/EBPα和PPARγ時，這些細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。用去甲基化試劑5-氮胞苷處理鼠胚胎細(xì)胞C3H10T1/2，可使一些細(xì)胞轉(zhuǎn)變成TAL細(xì)胞系[6]。

1.2 前脂肪細(xì)胞系

3T3-L1細(xì)胞系分離自Swiss小鼠的脂肪纖維細(xì)胞，是使用范圍最廣的脂代謝細(xì)胞模型，主要應(yīng)用于胰島素敏感性與抵抗[7]，脂質(zhì)合成與降解代謝[8]，脂肪與其他組織的代謝關(guān)系等相關(guān)研究[9]。其經(jīng)典培養(yǎng)方式為含10%牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，但其誘導(dǎo)分化培養(yǎng)條件在不同的研究中差別較大。雞尾酒法在第一階段采用500 μmol/L，M3-異丁基-1-甲基黃嘌 (IBMX)、0.25～1 μmol/L地塞米松與1～10 μg/mL 胰島素聯(lián)合誘導(dǎo)，聯(lián)合誘導(dǎo)時間存在一定差異，第二階段則用相同濃度的胰島素單獨誘導(dǎo)。有研究者針對其誘導(dǎo)分化條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其中IBMX的用量、聯(lián)合誘導(dǎo)時間與胰島素單獨使用量是影響3T3-L1細(xì)胞分離培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[7]。3T3-F442A細(xì)胞系和OB17細(xì)胞系均分離自小鼠，與3T3-L1細(xì)胞具有完全相同的培養(yǎng)條件和分化方式。除此以外，Hugo等[10]建立了能夠產(chǎn)生催乳素和催乳素應(yīng)答的LS14細(xì)胞系；Wolins等[11]建立了具有快速分化能力的OP9細(xì)胞系，能夠很大程度上加快脂肪代謝體外研究過程。

1.3 棕色化脂肪細(xì)胞系

通過嬰兒皮下棕色脂肪組織為來源構(gòu)建的PZA6細(xì)胞系是現(xiàn)階段使用率較高的棕色化脂肪細(xì)胞系[12]。該細(xì)胞系在胰島素等外源刺激下能夠誘導(dǎo)生成含有脂滴的脂肪細(xì)胞，同時具有較高的UCP1表達(dá)。分化過程中需要添加高質(zhì)量的噻唑烷二酮，能夠誘導(dǎo)米色脂肪的生產(chǎn)[13]。該細(xì)胞系在誘導(dǎo)過程中存在較大的異質(zhì)性，同時含有棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞，對分子機(jī)制的研究工作存在一定的困擾。除此以外，現(xiàn)階段還存在BFC-1、HB2、RBM-Ad、HIB 1B、T37i等棕色脂肪細(xì)胞系[14]。

1.4 原代脂肪細(xì)胞模型

原代脂肪細(xì)胞根據(jù)其培養(yǎng)方式和同質(zhì)性程度可分為基質(zhì)血管成分細(xì)胞(Stromal vascular fraction，SVF)，脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells，ASCs)和去分化脂肪細(xì)胞(Dedifferentiated fat cells，DFAT)。SVF細(xì)胞指通過消化法建立的脂肪細(xì)胞異質(zhì)群，其細(xì)胞模型建立時間短，可操作性強(qiáng)，是最常見的脂肪細(xì)胞模型。ASCs細(xì)胞經(jīng)過了純化過程，具有較強(qiáng)的同質(zhì)性，且擁有多向分化潛能，可誘導(dǎo)成脂、成軟骨和成骨[15]。DFAT細(xì)胞經(jīng)過天花板培養(yǎng)法以成熟脂肪細(xì)胞為供體，通過體外培養(yǎng)去分化獲得擁有一定增殖和分化能力且同質(zhì)性較強(qiáng)的前脂肪細(xì)胞模型[16]。3種細(xì)胞培養(yǎng)方案均能夠應(yīng)用于白色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)過程當(dāng)中，但棕色脂肪細(xì)胞因其僅含有眾多小脂滴，其密度較成熟白色脂肪高，因此棕色脂肪細(xì)胞模型建立多采用消化法[17]。

2 細(xì)胞模型建立與分化

2.1 消化法建立脂肪細(xì)胞模型

目前酶消化法是可行性最高、效果最穩(wěn)定的原代脂肪細(xì)胞模型建立方法，通過機(jī)械剪碎、酶消化、過濾并結(jié)合差速貼壁純化等方式獲得SVF細(xì)胞，具有廣泛的物種通用性。該方法建模速度較快，但前脂肪細(xì)胞純度受到一定的限制，同時細(xì)胞活力和細(xì)胞傳代能力也較組織塊法有所下降。現(xiàn)階段并沒有一種標(biāo)準(zhǔn)化的采用消化法建立脂肪細(xì)胞模型的方案。因此，眾多研究者通過結(jié)合差速貼壁等方法試圖提升其前脂肪細(xì)胞純度，通過優(yōu)化酶的使用量、消化時間、種類和進(jìn)行不同的組合減少長時間消化對細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞篩孔目大小與物種間細(xì)胞大小差異和不同脂質(zhì)積累程度造成的細(xì)胞大小差異具有一定的聯(lián)系，且長時間和高速離心對脂肪細(xì)胞模型建立過程中細(xì)胞活性存在較大的傷害，故推薦較短離心時間和較低離心速度[18]。

2.2 組織塊法建立脂肪細(xì)胞模型

組織塊法培養(yǎng)脂肪細(xì)胞模型也廣泛應(yīng)用于脂代謝相關(guān)研究。通過分離脂肪組織，剝離結(jié)締組織和血管等雜質(zhì)，剪為1 mm3左右組織塊進(jìn)行倒置培養(yǎng)，待貼牢后正置培養(yǎng)至脂肪組織細(xì)胞由組織中遷出。有研究者發(fā)現(xiàn)，低劑量輻射處理能夠提升天花板培養(yǎng)法脂肪細(xì)胞模型的活性[19]。脂肪細(xì)胞外周結(jié)締組織膜結(jié)構(gòu)束縛細(xì)胞遷出，基于實驗室前期研究，當(dāng)解除外周結(jié)締組織包被后，脂肪細(xì)胞遷出能力得到了極大的提升。脂肪組織來源同樣對組織塊法建立脂肪細(xì)胞具有極其明顯的差異，幼齡動物脂肪組織遷出能力強(qiáng)，成年動物則很難遷出前脂肪細(xì)胞。有研究表明組織塊法培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，在后續(xù)脂肪細(xì)胞分化過程當(dāng)中表現(xiàn)出分化同步性差和分化能力差異大等問題[18]?；谏鲜鲇^點，為充分利用組織塊培養(yǎng)法建立脂肪細(xì)胞模型細(xì)胞活力強(qiáng)的優(yōu)點，結(jié)合差速貼壁等手段對其進(jìn)行細(xì)胞純化將是一種可行的策略。

2.3 其他方法建立脂肪細(xì)胞模型

2.3.1 二次天花板法與改良天花板法 二次天花板法先通過消化法結(jié)合低速離心獲取密度低于消化介質(zhì)的含有大量脂滴的上層成熟脂肪細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以倒置培養(yǎng)的方式使得細(xì)胞于天花板貼壁，通過一定時間的去分化過程完全貼壁后再正置培養(yǎng)，不斷增殖獲得DFAT細(xì)胞。此種方式的優(yōu)勢為獲得細(xì)胞模型同質(zhì)性較強(qiáng)，但培養(yǎng)液消耗極大。有研究者通過在培養(yǎng)皿中放置蓋玻片的方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)的天花板法，此法極大的減少了培養(yǎng)基的使用量，且具有較好的細(xì)胞模型建立效果，但天花板培養(yǎng)法較消化法獲得細(xì)胞具有較差的分化能力[20]。所以，細(xì)胞純度提升和細(xì)胞分化能力下降的矛盾仍是天花板法培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的亟待解決的問題。

2.3.2 差速貼壁法 差速貼壁法主要應(yīng)用于脂肪細(xì)胞純化過程，利用成熟脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞之間的貼壁速度差異分離出純度較高的脂肪細(xì)胞。主要應(yīng)用于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分離工作[21]。但其分離效果受細(xì)胞狀態(tài)影響較大，細(xì)胞活性差異導(dǎo)致的貼壁速度差異對富集的細(xì)胞純度產(chǎn)生了較大的影響，多次差速貼壁可能是一種解決原始方案中細(xì)胞異質(zhì)性的可行方式。

2.3.3 其他培養(yǎng)方式 結(jié)合脂肪細(xì)胞相關(guān)特性和其他異質(zhì)性細(xì)胞的純化方式，提出了幾種可行的方式：高純度的前脂肪細(xì)胞模型建立可采用細(xì)胞標(biāo)志maker進(jìn)行流式篩選[22]；充分利用不同細(xì)胞密度差異通過差速離心或者密度梯度離心等方式獲得較為同質(zhì)化的細(xì)胞[23]；通過將原代脂肪細(xì)胞建立細(xì)胞系的方式獲得永久保存的細(xì)胞系[24]。

3 原代脂肪細(xì)胞模型生物學(xué)差異

3.1 不同動物脂肪沉積部位差異

物種間脂肪組織發(fā)育方式存在差異，有報道稱脂肪組織可能的來源是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，因脂肪干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞具有極大的相似性[25]。不同動物的脂肪組織發(fā)生部位不同，豬脂肪組織發(fā)源于背側(cè)，而以牛為代表的反芻動物脂肪組織發(fā)生于腹側(cè)，在脂肪沉積的過程當(dāng)中，脂肪組織不斷遷至全身不同部位。不同動物具有不同的脂肪組織形式，豬具有較多的皮下脂肪沉積，且皮下脂肪組織具有明顯的分層現(xiàn)象，牛和雞具有極強(qiáng)的腹部脂肪沉積能力，但雞并不具有沉積皮下脂肪的能力，綿羊和山羊具有較強(qiáng)的肌內(nèi)脂肪和肌間脂肪沉積能力，但綿羊具有獨特的尾脂沉積能力。不同脂肪沉積部位使得在脂代謝模型建立上具有一定的選擇性和特異性。細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中仍能保存一定的體內(nèi)特征，所以通過以不同部位脂肪組織為來源建立脂肪細(xì)胞模型可能對脂肪組織的發(fā)生過程和不同部位脂肪代謝差異具有一定的研究意義。

3.2 動物脂肪沉積的性別差異

受類固醇代謝和其他兩性差異代謝的影響，脂肪沉積在不同物種間具有較大的差異性，在人類當(dāng)中，性別差異導(dǎo)致的脂肪沉積部位不同尤為明顯，男性多趨向予蘋果型肥胖，女性更趨向于梨形肥胖。Aksu等[26]研究表明，以女性脂肪組織為供體的細(xì)胞模型較男性具有較弱的分化能力、較低的死亡率和較快的生長速率。體外建立脂肪細(xì)胞模型同樣會部分保留活體動物部分類固醇激素代謝效應(yīng)。

3.3 白色、棕色和米色脂肪組織差異

脂肪組織通?？煞譃榘咨窘M織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織，其在組織功能和形態(tài)學(xué)上存在較大差異。白色脂肪組織將甘油三酯儲存于細(xì)胞質(zhì)中的脂滴中，能夠分泌大量的激素及細(xì)胞因子影響和調(diào)控其他組織和機(jī)體整體代謝，過多的白色脂肪沉積可能導(dǎo)致代謝平衡紊亂，產(chǎn)生脂代謝相關(guān)病癥[27]。白色脂肪組織和米色脂肪組織均由Myf5-細(xì)胞型分化而來，棕色脂肪來源于Myf5+細(xì)胞型。米色脂肪和棕色脂肪擁有相似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，二者均具有較多的線粒體結(jié)構(gòu)，米色脂肪可視為白色脂肪在冷刺激下經(jīng)過一系列變化趨向于棕色脂肪的現(xiàn)象，二者均能夠檢測到高水平的UCP-1表達(dá)。分別以白色脂肪組織和棕色脂肪組織所建立脂肪細(xì)胞模型具有完全不同的生物學(xué)特性。有研究者發(fā)現(xiàn)，體外通過藥物誘導(dǎo)可促進(jìn)白色脂肪的棕色化進(jìn)程[28]。

3.4 動物年齡對細(xì)胞活性的影響

供體年齡對原代脂肪細(xì)胞模型的建立具有較大的影響。眾多研究發(fā)現(xiàn)，供體年齡與脂肪組織細(xì)胞活性和遷出能力成負(fù)相關(guān)[29]。取材于幼齡的動物脂肪組織在脂肪細(xì)胞模型建立過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的分裂能力和較好的生物學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)[30]。這種“增殖”活性并不等同于細(xì)胞在體外增殖速率的差異，主要表現(xiàn)為構(gòu)建細(xì)胞模型的難易程度和細(xì)胞產(chǎn)量，造成這種差異的原因可能是隨著年齡的不斷增長，脂肪干細(xì)胞的衰老基因表達(dá)量上升，且細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持能力明顯下降[31]。但部分研究者發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老與年齡沒有必然的聯(lián)系，且脂肪細(xì)胞的體外增殖能力和分化能力與其供體年齡并不具有顯著相關(guān)關(guān)系?，F(xiàn)階段，研究者對供體年齡與脂肪細(xì)胞模型建立的關(guān)系研究并不統(tǒng)一，未能對以幼齡動物為供體建立脂肪細(xì)胞模型的優(yōu)勢進(jìn)行合理的生物學(xué)鑒定與分析[32]。

3.5 脂肪細(xì)胞的分化與去分化

脂肪細(xì)胞離體后，解除機(jī)體激素和營養(yǎng)水平等調(diào)節(jié)因素，其在結(jié)構(gòu)功能上會發(fā)生一定程度的生物學(xué)變化，這種變化并不能完全解除機(jī)體本身對原代細(xì)胞造成的影響。盡管很早就有研究報道，前脂肪細(xì)胞需要通過G0期阻滯才能夠具有分化潛能[33]，但現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)接觸抑制并非脂肪細(xì)胞分化的必要條件。不可否認(rèn)的是，細(xì)胞分化的核心信號是染色質(zhì)表觀遺傳模式的轉(zhuǎn)變，由分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)移至分化狀態(tài)。有研究表明脂肪細(xì)胞分化的表觀遺傳事件發(fā)生于解除抑制期并非誘導(dǎo)期[34]。同時研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞體外分化階段被分割為兩個相對獨立的階段，細(xì)胞因接觸抑制獲得分化潛能階段和激素等細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子刺激下執(zhí)行分化過程階段[35]。

基于實驗室研究基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，在一定時間和代數(shù)內(nèi)，牛脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)代數(shù)與時間的延長會使細(xì)胞模型更多的脫離生物機(jī)體對其造成的影響，不同組織來源的細(xì)胞模型會趨向生物學(xué)統(tǒng)一。研究發(fā)現(xiàn)，其中甲基化的變化，細(xì)胞線粒體的消亡和再生[36]，血清細(xì)胞生長因子的缺失可能是體外脂肪細(xì)胞去分化和再分化的重要原因[37]。

4 小 結(jié)

肥胖正在逐漸侵蝕人類的健康，但迄今為止，對于這一問題的解決方案并不完全成功，側(cè)面也說明了現(xiàn)階段研究者對脂肪細(xì)胞生物學(xué)和生理病理學(xué)的相關(guān)研究還存在不足。為了更好地了解脂肪細(xì)胞的功能，我們需要不斷改進(jìn)脂肪細(xì)胞模型，使其在表達(dá)體內(nèi)狀態(tài)時具有高度的保真度，并具有不同的實驗應(yīng)用范圍[38]。隨著脂肪沉積與脂代謝研究的不斷深入，研究者對于脂肪組織的認(rèn)識也在逐漸產(chǎn)生變化，起初將脂肪組織僅視為一種能量貯存器官，到現(xiàn)階段將其同時視為一種免疫器官和內(nèi)分泌器官[41]。脂肪細(xì)胞模型是脂代謝相關(guān)研究的重要媒介，通過建立原代脂肪細(xì)胞模型和利用現(xiàn)有的眾多細(xì)胞系，研究者對人類脂代謝相關(guān)疾病和動物脂肪沉積相關(guān)功能有了長足的認(rèn)識。深刻認(rèn)識脂肪組織的物種間差異、部位差異、組織結(jié)構(gòu)差異、年齡差異和性別差異等因素，對原代脂肪細(xì)胞模型建立具有十分重要作用，也將為更好的進(jìn)行脂代謝和脂肪沉積相關(guān)研究鋪平道路。