李 媛,華榮茂,段家昕,陳華麗,徐德軍,楊 麗,程建勇,李曉亞,耿果霞,李青旺*
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
人卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)是由下丘腦控制的垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白類促性腺激素,它是一種由FSHα亞基與FSHβ亞基通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合形成的異源二聚體糖蛋白[1]。其中FSHα亞基基因編碼了92個(gè)氨基酸,包含10個(gè)半胱氨酸,形成5個(gè)二硫鍵;FSHβ亞基基因編碼了111個(gè)氨基酸,其中包含12個(gè)半胱氨酸,形成6個(gè)二硫鍵[2]。FSH在人體中發(fā)揮重要的作用,在女性體內(nèi)主要促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)、卵泡的發(fā)育和排卵等[3],在男性體內(nèi)可以刺激次級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)育以及精子的產(chǎn)生,通過(guò)與 LH 及雄激素發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)精子的成熟[4]。
FSH在臨床上主要用于輔助生殖方面超數(shù)排卵等功能。目前市場(chǎng)對(duì)于FSH產(chǎn)品的需求巨大,市面上主要有兩種FSH產(chǎn)品,一種是尿源的FSH,另一種是國(guó)外進(jìn)口的基因工程重組FSH(rhFSH)蛋白,國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用上進(jìn)口rhFSH占據(jù)主要市場(chǎng)。rhFSH相比尿源FSH有純度高、生物活性高、來(lái)源均一的特點(diǎn),且無(wú)LH及其他雜蛋白的污染[5],但是國(guó)外進(jìn)口的rhFSH主要是細(xì)胞表達(dá)的基因工程產(chǎn)品,受制于細(xì)胞表達(dá)量低的缺點(diǎn),生產(chǎn)成本較高,因此進(jìn)口rhFSH價(jià)格較為昂貴。目前動(dòng)物乳腺制備蛋白藥物是藥物制備的熱門(mén)研究領(lǐng)域,動(dòng)物乳腺制備重組蛋白藥物具備產(chǎn)量高、價(jià)格低的優(yōu)勢(shì)[6]。但是動(dòng)物乳腺制備FSH的研究還停留在鼠和兔等小動(dòng)物層面[7-8],未見(jiàn)大動(dòng)物制備FSH相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)。本研究旨在構(gòu)建重組人FSH基因腺病毒表達(dá)載體,利用羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)表達(dá)人FSH重組蛋白,并驗(yàn)證其體外生物學(xué)活性,為大動(dòng)物乳腺制備人FSH奠定前期研究基礎(chǔ)。
1.1.1 質(zhì)粒與菌株 pAdTrack-CMV、pAdEasy-1購(gòu)自優(yōu)寶生物;pIRES-FSH-neo3表達(dá)載體、pIRES-FSHR-puro3表達(dá)載體、HEK293A細(xì)胞、HEK293T-FSHR細(xì)胞、GMEC細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、BJ5183菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 主要試劑 T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司;質(zhì)粒小提試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;蛋白質(zhì) Marker (MP102)、D2000 DNA Marker、D15000 DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司、SDS Page凝膠試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、胎牛血清購(gòu)自碧云天;His tag標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì);Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司;3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購(gòu)自Sigma公司;Anti-FSH兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司;cAMP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。
1.2.1 重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建是基于實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建好的pIRES-FSH-neo3表達(dá)載體的基礎(chǔ)上亞克隆得到的。根據(jù)GenBank中人FSH的序列(NP_000726.1,NP_000501.1),以pIRES-FSH-neo3載體為模板,設(shè)計(jì)上游引物F:AGATCTATGGACTACTACAGGAAGT(BglII),下游引物R: AAGCTTCTAATGATGGTGGTGATGGTGAC(HindIII),經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠檢測(cè),切膠回收目的基因片段。將目的基因片段和穿梭載體pAdTrack-CMV用BglII和HindIII限制性內(nèi)切酶雙酶切,通過(guò)T4連接酶連接得到pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體。用BglII和HindIII雙酶切驗(yàn)證以及測(cè)序驗(yàn)證穿梭載體的正確性。用PmeI酶將pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體線性化,切膠回收載體,將其轉(zhuǎn)化到含有pAdEasy-1骨架載體的BJ5183感受態(tài),在含卡那霉素的LB平板上過(guò)夜生長(zhǎng)。挑取平板上較小的菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,并用PacI酶切驗(yàn)證目的基因是否與骨架載體重組得到腺病毒載體pAdEasy-FSH/His,同時(shí)測(cè)序驗(yàn)證重組腺病毒載體的正確性。
1.2.2 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增與滴度測(cè)定 將HEK 293A細(xì)胞復(fù)蘇后傳代到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,確保24 h后細(xì)胞匯合度為50%左右,將已經(jīng)測(cè)序正確的線性化腺病毒表達(dá)載體pAdEasy-FSH/His和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按照1:3(3 μg質(zhì)粒:9 μL脂質(zhì)體)的比例轉(zhuǎn)染HEK 293A,轉(zhuǎn)染4~6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染3 d后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),每2~3 d添加少量新鮮培養(yǎng)基。到10~14 d后,細(xì)胞幾乎全部可以觀察到熒光,并且細(xì)胞呈葡萄球狀且大量漂起,此時(shí)可收集第一代病毒。用第一代病毒感染HEK 293A細(xì)胞,擴(kuò)增后收集第二代病毒,如此反復(fù),收集得到第三代腺病毒,用LaSRT法測(cè)定第三代腺病毒滴度。
1.2.3 重組人FSH腺病毒感染GMEC細(xì)胞 感染前確定腺病毒感染的最佳MOI值,將實(shí)驗(yàn)室凍存的GMEC細(xì)胞復(fù)蘇,在DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%FBS)、37 ℃和5% CO2下經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后,按1×105個(gè)接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后,分別用MOI值為60、100、140、180、220、260的重組腺病毒感染乳腺上皮細(xì)胞,每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù),2 h后換新鮮的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后觀察GFP熒光情況和細(xì)胞病變狀況,選擇轉(zhuǎn)染效率高且病變作用小的作為最佳感染復(fù)數(shù)。用最佳感染復(fù)數(shù)感染GMEC細(xì)胞48 h后,收集活細(xì)胞蛋白。
1.2.4 Western blot鑒定rhFSH在GMEC的表達(dá) 制備12%的分離膠和5%的濃縮膠,進(jìn)行SDS-PAGE(蛋白樣品15 μL,非還原上樣緩沖液,濃縮膠80 V,分離膠100 V);將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,4 ℃下用5%的脫脂奶粉過(guò)夜封閉;將PVDF膜置于TBST緩沖液配置的抗FSH多克隆抗體中,4 ℃過(guò)夜孵育;TBST洗膜4次,每次10 min;用羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗在4 ℃下孵育4 h;TBST洗膜4次,每次10 min;用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后在化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光,觀察目的蛋白的表達(dá)情況。
1.2.5 rhFSH重組蛋白的純化 將含金屬Ni的瓊脂糖填料混勻后裝入層析柱,排出柱中乙醇,用10倍柱體積的上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L 咪唑,0.5 mmol/L NaCl)平衡鎳柱。樣品過(guò)柱完成后,用洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L 咪唑,0.5 mol/L NaCl)沖洗去部分雜蛋白。用適量洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L 咪唑,0.5 mol/L NaCl)將鎳柱上的目的蛋白洗脫下來(lái)并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。
1.2.6 體外驗(yàn)證rhFSH的生物學(xué)功能 將實(shí)驗(yàn)室建立并且保存的人卵泡刺激素受體(FSHR)基因的穩(wěn)定細(xì)胞株HEK-293-FSHR進(jìn)行復(fù)蘇,按照2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入0.1 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX),培養(yǎng)24 h。將純化的rhFSH蛋白作為試驗(yàn)組、Gonal-F作為陽(yáng)性對(duì)照組,分別用培養(yǎng)基稀釋后加入到細(xì)胞中,空白組細(xì)胞只加等體積的完全培養(yǎng)基,每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)1h,裂解細(xì)胞后用cAMP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞cAMP的含量。
以pIRES-FSH-neo3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1A 。擴(kuò)增片段約820 bp,大小與人FSH一致?;厥漳康幕蚱?,經(jīng)過(guò)BglⅡ和HindⅢ雙酶切后與pAdTrack-CMV連接,產(chǎn)物經(jīng)酶切及瓊脂糖凝膠電泳,獲得了約9 100 bp的穿梭載體及約820 bp的目的基因條帶(圖1B),穿梭載體pAdTrack-CMV-FSH/His構(gòu)建成功。將pAdTrack-CMV-FSH/His用PmeⅠ酶切后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1骨架載體的BJ5183大腸桿菌感受態(tài),挑取4個(gè)單克隆菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)有2個(gè)菌落中提取的質(zhì)粒與穿梭載體條帶不同,可能是重組后的腺病毒載體。以這2個(gè)質(zhì)粒為模板進(jìn)一步用PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)質(zhì)粒中都可以獲得大小約820 bp的目的基因條帶(圖2),說(shuō)明成功構(gòu)建了pAdEasy-FSH/His腺病毒表達(dá)載體。
將重組腺病毒載體用PacI酶線性化后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到HEK 293A細(xì)胞中,3 d后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),6 d后綠色熒光表達(dá)量明顯增加,9 d后細(xì)胞出現(xiàn)大量彗星狀綠色熒光,13 d時(shí)有50%細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底脫落,細(xì)胞成葡萄球形狀,此時(shí)可以收集P1代病毒,細(xì)胞感染腺病毒效果如圖3所示。用第一代病毒繼續(xù)感染HEK 293A細(xì)胞得到第二代和第三代腺病毒,第三代腺病毒具有較高的病毒滴度,可以用來(lái)感染GMEC細(xì)胞細(xì)胞。用LaSRT法測(cè)定測(cè)定第三代病毒滴度,如圖4所示,隨著孔數(shù)的增加,綠色熒光逐漸變暗,即隨著病毒濃度的降低,熒光逐漸減少。重組腺病毒在第8個(gè)孔時(shí),綠色熒光數(shù)不足5個(gè),并且在第9個(gè)孔后完全黑暗,因此計(jì)算病毒滴度為1×109PFU/mL。
用得到的第三代腺病毒感染GMEC細(xì)胞,經(jīng)過(guò)觀察GFP熒光表達(dá)量以及細(xì)胞的病變程度發(fā)現(xiàn),當(dāng)重組人FSH腺病毒感染復(fù)數(shù)為180時(shí),細(xì)胞未出現(xiàn)明顯病變且綠色熒光表達(dá)量較多,效果最好,滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。用最佳感染復(fù)數(shù)感染GMEC細(xì)胞48 h后,明顯能夠觀察到綠色熒光蛋白的大量表達(dá)(圖5)。收集經(jīng)過(guò)腺病毒感染與未被腺病毒感染的活細(xì)胞蛋白,通過(guò)Western blotting鑒定后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)重組FSH腺病毒感染的GMEC細(xì)胞蛋白在大約40 kDa大小的地方有明顯條帶出現(xiàn),未經(jīng)過(guò)腺病毒感染的GMEC細(xì)胞蛋白在同樣的位置未見(jiàn)條帶出現(xiàn),結(jié)果表明人FSH目的基因成功在GMEC細(xì)胞中表達(dá)(圖6)。
用鎳柱純化GMEC細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果見(jiàn)圖7,得到大小在40 kDa左右的蛋白條帶,與2.3結(jié)果中目的蛋白大小結(jié)果一致,表明用鎳柱成功純化得到了rhFSH蛋白,為下一步鑒定蛋白體外生物活性奠定基礎(chǔ)。
FSH受體(FSHR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),F(xiàn)SH激活FSHR后,F(xiàn)SHR誘導(dǎo)細(xì)胞合成cAMP。在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了GMEC細(xì)胞表達(dá)的rhFSH及陽(yáng)性對(duì)照Gonal-F后,若FSH具備活性,穩(wěn)定表達(dá)FSHR的HEK 293A細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生cAMP,通過(guò)裂解細(xì)胞,用cAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的含量可以表明FSH的生物學(xué)功能。圖8中結(jié)果表明,培養(yǎng)基中添加了GMEC細(xì)胞表達(dá)的rhFSH和陽(yáng)性對(duì)照Gonal-F兩個(gè)組誘導(dǎo)HEK 293-FSHR細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP與空白對(duì)照組比差異極顯著(P<0.01),這說(shuō)明GMEC細(xì)胞表達(dá)的rhFSH具備和商品化的基因工程產(chǎn)品Gonal-F一樣的體外生物活性。
人卵泡刺激素是由腦垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素,它是由FSHα亞基蛋白以及FSHβ亞基蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合組成的異源二聚體糖蛋白[9-11]。目前FSH在臨床上主要用于輔助生殖,治療不孕不育,市場(chǎng)潛力巨大[12-13]。卵泡刺激素有腦垂體來(lái)源FSH、尿源FSH以及基因重組FSH。腦垂體FSH由于腦垂體來(lái)源少、不易獲得,價(jià)格昂貴,所能提取到的FSH純度不高以及其他的一些毒副作用等缺點(diǎn),使得垂體FSH無(wú)法被市場(chǎng)廣泛應(yīng)用而退出市場(chǎng)[14]。而尿源FSH是從絕經(jīng)期婦女的尿液里面提取的,早期工藝比較落后時(shí),尿源FSH里面含的大量促黃體素(LH)及其他的雜蛋白會(huì)給治療效果帶來(lái)很大影響?;蛑亟MFSH有著純度高、安全性高、活性高和來(lái)源均一等優(yōu)勢(shì)[15]。由于FSH的糖基化過(guò)程對(duì)于其生物活性有非常重要的作用,因此需要通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組FSH[16]。目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的用于基因工程制備重組FSH的表達(dá)系統(tǒng)主要有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)[17-19]。本研究利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞GMEC表達(dá)rhFSH蛋白,GMEC細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)一樣具備糖基化功能,經(jīng)過(guò)體外活性試驗(yàn)驗(yàn)證GMEC表達(dá)的rhFSH和目前上市的Gonal-F一樣具備良好的體外生物活性。
GMEC細(xì)胞與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等不同,較難轉(zhuǎn)染,因此選擇一種高效的轉(zhuǎn)染體系對(duì)于在GMEC細(xì)胞表達(dá)rhFSH尤為重要。腺病毒表達(dá)體系具有宿主范圍廣、致病性低、表達(dá)效率高、不受細(xì)胞是否分裂的影響、操作簡(jiǎn)便且病毒滴度高等優(yōu)點(diǎn)[20]。并且目前還沒(méi)有以腺病毒感染動(dòng)物乳腺細(xì)胞制備FSH的研究報(bào)導(dǎo)。本研究采用了腺病毒轉(zhuǎn)染GMEC細(xì)胞來(lái)獲取rhFSH蛋白,通過(guò)構(gòu)建重組人FSH腺病毒載體在HEK-293A細(xì)胞中包裝得到重組人FSH腺病毒,重組人FSH腺病毒感染GMEC細(xì)胞后在細(xì)胞培養(yǎng)上清以及細(xì)胞質(zhì)中獲取了大量可溶的rhFSH,這為下一步獲取純度較高的rhFSH用于體外活性檢測(cè)奠定基礎(chǔ),這也表明了GMEC細(xì)胞具備良好的分泌外源rhFSH蛋白的潛力。
相比細(xì)胞工程制備重組蛋白藥物,如今利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組蛋白藥物是較為熱門(mén)的研究方向,這種方法和細(xì)胞工程方法制備FSH相比具有產(chǎn)量高、價(jià)格低的優(yōu)勢(shì),不過(guò)目前相關(guān)方面的研究報(bào)道較少,只有少數(shù)在小鼠和兔子這類小動(dòng)物乳腺中制備得到具備生物活性的重組FSH的研究報(bào)導(dǎo)[8,21],這說(shuō)明通過(guò)大動(dòng)物乳腺制備重組FSH是可行的。為了探索將來(lái)進(jìn)一步利用大動(dòng)物生產(chǎn)人FSH蛋白藥物,本研究選擇山羊乳腺組織行使泌乳功能的GMEC細(xì)胞作為表達(dá)rhFSH的系統(tǒng),構(gòu)建了腺病毒表達(dá)載體包裝得到重組人FSH腺病毒,在體外感染GMEC細(xì)胞后制備了大量的rhFSH蛋白,并驗(yàn)證了rhFSH蛋白具備體外生物活性,在體外細(xì)胞層面驗(yàn)證了大動(dòng)物乳腺制備rhFSH的可行性,這為大動(dòng)物乳腺制備rhFSH奠定了良好的研究基礎(chǔ)。
本研究通過(guò)構(gòu)建人FSH基因腺病毒表達(dá)載體,利用羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)表達(dá)人FSH基因,經(jīng)過(guò)Western blotting檢測(cè)GMEC細(xì)胞可以成功表達(dá)rhFSH蛋白。GMEC細(xì)胞表達(dá)的rhFSH經(jīng)過(guò)純化后通過(guò)體外生物活性驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)其具備Gonal-F同樣的體外生物功能,這為大動(dòng)物乳腺制備人FSH奠定了前期的研究基礎(chǔ)。