胃癌高發(fā)區(qū)幽門(mén)螺桿菌對(duì)胃上皮細(xì)胞系GES1蛋白質(zhì)組的影響

魏思思，鄧曉晴，王 莧，薛永嫻，黃永勝，趙連梅，單保恩*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 科研中心， 河北 石家莊 050011； 2.石家莊市疾病控制與預(yù)防中心，河北 石家莊 050011； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 北京 100005)

幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將H.pylori歸類(lèi)為“Ⅰ類(lèi)”致癌因子[2]。胃癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第5(5.7%)，死亡率排第3(8.2%)[3]。H.pylori還能夠引起其他多種消化道疾病，包括胃炎、消化性潰瘍病、胃食管反流病和消化不良等[4]。毒力因子cagA(cytotoxin-associa-ted gene A)和vacA(vacuolating cytotoxin A)是H.pylori相關(guān)疾病主要決定因素[5]。研究表明，慢性炎性反應(yīng)被認(rèn)為是癌的標(biāo)志，免疫細(xì)胞的異常激活和炎性細(xì)胞因子的過(guò)度分泌促進(jìn)胃癌的發(fā)展[6]。H.pylori可直接導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，并通過(guò)刺激產(chǎn)生間接導(dǎo)致DNA損傷的活性氧和活性氮[7]。因此，本研究分離了胃癌高發(fā)區(qū)H.pylori菌株，旨在通過(guò)研究高致病性H.pylori對(duì)GES1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組的影響，進(jìn)一步闡明H.pylori誘導(dǎo)胃癌的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人永生化胃上皮細(xì)胞系GES1(北京腫瘤防治研究所柯楊教授課題組惠贈(zèng))。

1.1.2 試劑及試劑盒：胎牛血清(BI)，1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Green PCR Kit(Promega公司)，RIPA裂解液(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 GES1細(xì)胞和H.pylori的培養(yǎng)：GES1細(xì)胞在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

河北省胃癌高發(fā)區(qū)井陘縣用C-13呼氣實(shí)驗(yàn)鑒定陽(yáng)性患者，胃鏡下取胃黏膜，徹底研磨后接種在Karmali血平板上，37 ℃、微需氧(CO210%、O25%、N285%)條件下培養(yǎng)3～4 d，純化出單個(gè)菌落后，并對(duì)基因型進(jìn)行鑒定，命名為H.pylori-400。H.pylori-400以MOI=50的比例與GES1細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。

1.2.2 RT-qPCR：GES1細(xì)胞與H.pylori-400共培養(yǎng)48 h后，加入Trizol試劑提取總RNA。用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為cDNA。用SYBR Green PCR Kit進(jìn)行q-PCR反應(yīng)。引物為IL-8: 上游引物5′-TACTCC AAACCTTTCCACCC-3′，下游引物 5′-CCTACAACAG ACCCACACAAT-3′； IL-1β：上游引物5′-AGCTAC GAATCTCCGACCAC-3′， 下游引物 5′CGTTATCC CATGTGTCGAAGAA3′； TNF-α：上游引物 5′-TTTCC GTGAAAACGGAGCTG-3′， 下游引物 5′-CACCCAC AAGAAGAGGCAGAT-3′?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法測(cè)定。

1.2.3 蛋白的提取和消化 GES1細(xì)胞與H.pylori-400共培養(yǎng)48 h后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，3 000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解30 min，超聲6次，95 ℃ 2 min使蛋白變性，12 000 r/min，離心10 min去除細(xì)胞碎片，收集蛋白上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)，BCA定量檢測(cè)蛋白濃度。

用FASP酶解消化蛋白(filter-aided sample preparation)。取150 μg蛋白加入10 k超濾管中離心濃縮；用含50 mmol/L DTT 的300 μL UA緩沖液(8 mol/L尿素,0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.5)37 ℃孵育 30 min打開(kāi)二硫鍵；用含50 mmol/L IAA的300 μL UA緩沖液暗處反應(yīng)30 min進(jìn)行烷基化；300 μL UA緩沖液置換3次，300 μL 50 mmol/L NH4HCO3置換2次；加入胰蛋白酶1∶100 (w/w) 37 ℃消化18 h。消化完成后，離心洗脫肽段，用自制C18小柱脫鹽，凍干后用0.1% FA溶解，最后肽段定量后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)組：用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)H.pylori處理過(guò)的GSE1細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，每個(gè)反應(yīng)上樣量為1 μg肽段。高效液相色譜分析用HPLC Easy-nLC 1200(Thermo Fisher Scientific公司)，流速為300 nL/min。緩沖液 A 為0.1% FA緩沖液，緩沖液B為0.1% FA的80% ACN。液相梯度設(shè)置如下：2%～8%緩沖液 B 1 min; 8%～28%緩沖液 B 60 min; 28%～37%緩沖液B 14 min; 37%～100%緩沖液B 5 min; 100%緩沖液B 10 min。蛋白質(zhì)組學(xué)分析采用Q Exactive HF質(zhì)譜儀 (Thermo Fisher Scientific公司)，設(shè)置為陽(yáng)離子模式，噴霧電壓2.1 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃，Xcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集。MS1設(shè)置為分辨率60 000，AGC target 3e6, maximum IT 20 ms，選擇top 20進(jìn)行MS2，分辨率為15 000，AGC target 1e5，maximum IT 45 ms。其他設(shè)置為fixed first mass 110.0 m/z，isolation window 1.6 m/z，NCE 27%，dynamic exclusion time 45 ms。

1.2.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：所有原始數(shù)據(jù)采用PD2.2軟件進(jìn)行l(wèi)able-free定量分析，鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot上下載的human FASTA文件。按照abundance ratio≥2或≤0.5的標(biāo)準(zhǔn)選擇差異表達(dá)蛋白。用在線軟件enrich.shbio.com進(jìn)行KEGG通路分析, Cytoscope的ClueGo插件進(jìn)行GO富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分離、培養(yǎng)并鑒定胃癌高發(fā)區(qū)H.pylori-400

分離出胃癌高發(fā)區(qū)的幽門(mén)螺桿菌臨床菌株后，革蘭染色下可以看到螺旋狀、S型和海鷗狀等不規(guī)則的革蘭陰性彎曲桿菌(圖1)；胃幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)試劑盒顯示，尿素酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。因此，初步鑒定為幽門(mén)螺桿菌。

圖1 革蘭染色鑒定幽門(mén)螺桿菌Fig 1 Identification of Helicobacter pylori by Gram staining

進(jìn)而，飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和16S rRNA測(cè)序方法證實(shí)為幽門(mén)螺桿菌。其基因型為CagA(+)、VacA(s1a、s2、m1b、i1)、iceA1、cagE2，并將其命名為H.pylori-400。

2.2 H.pylori-400對(duì)GES1細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，GES1細(xì)胞加入H.pylori-400后，細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with mock group圖2 H.pylori-400感染GES1細(xì)胞后對(duì)炎性因子表達(dá)的影響Fig 2 Effect of H.pylori-400 infection on the expression of inflammatory factors in GES1 cells

2.3 Lable-free定量質(zhì)譜分析

高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜共鑒定出3 959個(gè)蛋白，差異表達(dá)蛋白為665，如圖3A火山圖所示。將這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，篩選出蛋白FDR可信度高，且在每個(gè)樣品中表達(dá)豐度都高的差異表達(dá)蛋白，共373個(gè)蛋白，其中143個(gè)蛋白降低，230個(gè)蛋白升高，熱圖分析如圖3B。

A.volcano plots; B.heat map圖3 質(zhì)譜分析篩選H.pylori-400感染GES1細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白Fig 3 Screening of differentially expressed proteins in GES1 cells infected with H.pylori-400 by mass spectrometry

2.4 差異蛋白富集分析

用Cytoscape的ClueGo軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析，在線軟件enrich.shbio.com進(jìn)行KEGG通路分析，這些通路包含細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、周期依賴(lài)蛋白激酶活性調(diào)控、T細(xì)胞免疫活性和細(xì)胞組分重組等(圖4A, B)。

圖4 差異表達(dá)蛋白的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)Fig 4 Go enrichment analysis (A) and KEGG pathway analysis (B) of differentially expressed proteins

2.5 Hub基因選擇及與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)String和Cytoscape的cytohubba插件聯(lián)合找出差異表達(dá)蛋白的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的前10位關(guān)鍵基因(hub)(圖5A，B)。其中ALB、RPL9、CASP3、WDR12、BOP1、POLR1A和EIF4A1在H.pylori-400感染的GES1細(xì)胞中表達(dá)升高(表1)，在the human protein atlas網(wǎng)站上預(yù)測(cè)hub基因與生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蛋白高表達(dá)與胃癌、肝癌和腎癌生存呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5C)。

圖5 差異表達(dá)蛋白的PPI中排名前10的關(guān)鍵基因(Hub)(A,B)及其與腫瘤預(yù)后的關(guān)系(C)Fig 5 Top 10 hub genes in PPI of differentially expressed proteins(A,B) and their relationship with tumor prognosis(C)

3 討論

H.pylori是已知的胃癌的最強(qiáng)危險(xiǎn)因素，因此，本研究分離了胃癌高發(fā)區(qū)的H.pylori-400，檢測(cè)了基因型，進(jìn)一步用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了H.pylori-400導(dǎo)致的正常胃上皮細(xì)胞GES1蛋白質(zhì)組的改變，初步探索該病原體引發(fā)胃癌的具體機(jī)制。

H.pylori的致病因子包括vacA、cagA、babA、hopQ、oipA和homA/B，其中，cagA和vacA是主要的毒力因子，vacA能夠促進(jìn)胃上皮細(xì)胞空泡化，并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[8]，cagA參與胃癌前病變，促進(jìn)黏膜炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖[9]。本研究中，臨床菌株H.pylori-400的基因型為vacA(s1a、s2、m1、i1)，cagA陽(yáng)性，明確其致病機(jī)制則更有意義。

胃癌的發(fā)病機(jī)制為慢性炎性反應(yīng)，繼而形成慢性非萎縮性胃炎，慢性萎縮性胃炎，腸化生，異型增生，最終形成胃腺癌。多種炎性因子參與H.pylori感染相關(guān)胃癌的發(fā)生及進(jìn)展。比如，H.pylori感染能夠誘導(dǎo)IL-1升高，IL-1是胃癌進(jìn)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因子[10]。IL-8是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化因子和激活因子，介導(dǎo)了強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)[11]。腫瘤壞死因子(TNF)是一種參與全身炎性和Th1反應(yīng)的細(xì)胞因子[12]。H.pylori-400感染GES1細(xì)胞后，炎性因子IL-8、IL-1β和TNF-α表達(dá)升高，表明H.pylori-400能夠促進(jìn)胃上皮炎性反應(yīng)。

表1 質(zhì)譜分析Hub基因的表達(dá)Table 1 Expression of hub genes analyzed by MS data

本研究利用HPLC-MS技術(shù)篩選出H.pylori-400感染后胃上皮細(xì)胞GES1中發(fā)生變化的蛋白，進(jìn)行富集分析后確定了許多典型的信號(hào)通路，這些通路通常在H.pylori感染時(shí)被激活，比如T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞組分重配、細(xì)胞周期蛋白活性及P53信號(hào)通路等發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。對(duì)這些網(wǎng)絡(luò)更透徹的了解將有助于開(kāi)發(fā)有針對(duì)性的途徑和效應(yīng)器，以提高臨床治療效益和疾病預(yù)防。

此外，本研究在差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)中篩選出了前10位Hub基因，它們與多種腫瘤的預(yù)后都顯著相關(guān)，其中BOP1在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中通過(guò)JNK通路促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，沉默POLR1A的表達(dá)可以穩(wěn)定抑癌基因P53信號(hào)通路[14]。EIF4A1的異常高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，并且與胃癌預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)[15]。

綜上所述，本文利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法能夠確定胃上皮細(xì)胞對(duì)H.pylori-400感染的反應(yīng)，這一技術(shù)和方法允許識(shí)別和驗(yàn)證新的蛋白靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)在H.pylori誘導(dǎo)的胃癌發(fā)生中起重要作用。