低密度脂蛋白受體表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

李怡華，杜郁，洪斌

·綜述·

低密度脂蛋白受體表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

李怡華，杜郁，洪斌

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，國家衛(wèi)生健康委員會抗生素生物工程重點實驗室（李怡華、杜郁、洪斌），中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物合成生物學(xué)重點實驗室（洪斌）

心血管疾病是世界范圍的主要死亡原因[1]，全球?qū)π难茴愃幬锏男枨蟪掷m(xù)增長。膽固醇代謝紊亂引起的血脂異常是公認(rèn)的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）性心血管疾病的主要發(fā)病因素，降低低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）成為抗 AS 藥物研發(fā)的重要策略[2]。低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）是機體通過內(nèi)吞機制清除血漿中 LDL-C 的關(guān)鍵受體，它和載脂蛋白 B（apolipoprotein B，ApoB）及前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是目前已知的個與家族性高膽固醇血癥常染色體顯性遺傳相關(guān)的基因，且后兩者都與 LDLR 通路直接相關(guān)，顯示 LDLR 在維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡方面具有核心地位[3]。增加 LDLR 表達(dá)可降低血漿膽固醇水平，目前臨床上常用的他汀類藥物是針對 LDLR 通路的代表藥物，因其確切的降血脂及抗氧化等功能而在心血管疾病的一級和二級預(yù)防中具有重要作用[4]；在此基礎(chǔ)上參與 LDLR 表達(dá)調(diào)控的 PCSK9 抑制劑的出現(xiàn)進(jìn)一步降低了心血管事件的風(fēng)險[5]，說明開發(fā)上調(diào) LDLR 表達(dá)的抗 AS 藥物對于滿足臨床應(yīng)用需求有重要意義。LDLR 的表達(dá)受到膽固醇等因素在多個水平的調(diào)控，深入探明 LDLR 表達(dá)的調(diào)控機制有助于在分子水平認(rèn)識 AS 的發(fā)病機制，并為尋找 AS 防治的潛在藥物靶點提供了新方向。

1 LDLR 概述

LDLR 是分布于細(xì)胞表面網(wǎng)格蛋白被膜竇區(qū)中的內(nèi)吞受體之一，可結(jié)合并內(nèi)化循環(huán)中的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）及其他含有 ApoB-100 和載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）的脂蛋白，是維持哺乳動物體內(nèi)脂代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵受體[6]。LDLR 廣泛分布于多種組織和細(xì)胞中，在肝臟中的表達(dá)尤為豐富。

結(jié)構(gòu)上，LDLR 包含 5 種功能結(jié)構(gòu)域，分別為半胱氨酸豐富的配體結(jié)合域（ligand-binding domain，LBD）、表皮生長因子前體同源域（epidermal growth factor precursor homology domain，EGFD）、含疏水基團的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD）、高度保守的胞質(zhì)尾域（cytoplasmic domain，CPD）以及富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的O-糖鏈結(jié)構(gòu)域（O-linked sugar domain，OLSD）[7]。各結(jié)構(gòu)域均具有獨特而重要的生理功能。其中，定位于氨基末端的 LBD 負(fù)責(zé)結(jié)合 LDL 和中間密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein，IDL）等配體；EGFD 中含有富含半胱氨酸的重復(fù)序列，可被進(jìn)一步細(xì)分為表皮生長因子樣重復(fù)序列 A（epidermal growth factor-like repeat A，EGF-A）和 EGF-B，參與配體-受體復(fù)合物的 pH 依賴性解離；CPD 參與了受體靶向有被小窩及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[8]。分布上，LDLR 在肝臟、腎上腺、卵巢和睪丸等組織以及動脈壁平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中均有分布，但不同組織細(xì)胞的 LDLR 活性差異較大，生理功能不同[6]。

迄今為止，LDLR 已被證實參與了人體多種病理和生理過程，人們對其在心血管疾病中作用的認(rèn)識已逐漸深化[9]。LDLR 的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等水平受到多種因素的調(diào)節(jié)，下面將逐一進(jìn)行介紹。

2 LDLR 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

LDLR 的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。位于基因 5' 端的全長約 200 bp 的啟動子區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平上起重要的調(diào)控作用，其上有 3 個富含 GC 的不完全重復(fù)序列（repeat 1 ~ 3）和 2 個富含 TA 的序列（TATA box 1-2），可結(jié)合特定轉(zhuǎn)錄因子來控制的轉(zhuǎn)錄（圖 1）[10]。Repeat 1 ~ 3 各長 16 bp，控制基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄及固醇調(diào)控的轉(zhuǎn)錄。其中，repeat 1 和 3 中含有與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白 1（specific protein 1，Sp1）的結(jié)合位點，核心序列分別為 5' CTCCTCCTC 3' 和 5' CTCCTCCCC 3'，Sp1 與其中任一位點的結(jié)合受阻均會使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性降低[11-12]。Repeat 2 中含有一段與固醇調(diào)節(jié)直接相關(guān)的核苷酸序列（5' ATCACCCCAC 3'），即固醇調(diào)節(jié)元件 1（sterol regulatory element-1，SRE-1），可與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）相互作用而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[13]。此外，兩個 TATA box 序列各長 7 bp，有非固醇調(diào)節(jié)元件（sterol-independent regulatory elements，SIRE）的結(jié)合位點與其重疊，包括核心序列為 5' TGCTGTAAA 3' 的 CCAAT 增強子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBP）結(jié)合位點和核心序列為 5' TGACGTGG 3' 的環(huán)腺苷酸（cyclic AMP，cAMP）反應(yīng)元件（cAMP response element，CRE）[14]。以上順式作用元件均位于轉(zhuǎn)錄起始位點（transcription start site，TSS）上游。根據(jù)調(diào)控方式的不同，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可分為固醇依賴和非固醇依賴的調(diào)控。

圖 1 LDLR基因啟動子區(qū)的主要順式作用元件

2.1 固醇依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

膽固醇是維持正常膜功能所必需的成分，可通過負(fù)反饋機制調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)胞內(nèi)膽固醇水平升高時，的轉(zhuǎn)錄被抑制。反之，當(dāng)細(xì)胞膽固醇儲存不足時，的轉(zhuǎn)錄被激活。此調(diào)節(jié)經(jīng) SRE-1 和 SREBPs 相互作用而得以控制。SREBPs 包括 3 種亞型，即 SREBP-1a、SREBP-1c 及 SREBP-2。其中 SREBP-2 在激活 LDLR 的表達(dá)中可能發(fā)揮了更重要的作用，在固醇依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色[15]。

在細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平豐富時，的轉(zhuǎn)錄被抑制。此時，膽固醇會結(jié)合到 SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）的固醇感應(yīng)域，SCAP 與 SREBP-2 前體結(jié)合成復(fù)合體，被胰島素誘導(dǎo)基因（insulin induced gene，INSIG）編碼蛋白錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無法與啟動子上的 SRE-1 結(jié)合，故的轉(zhuǎn)錄僅維持在最低水平[16]。反之，當(dāng)細(xì)胞缺乏膽固醇時，的轉(zhuǎn)錄被激活。此時 SCAP-SREBP-2 復(fù)合體與 INSIG 分離并運往高爾基體，經(jīng)水解釋放出成熟形式的 SREBP-2，隨后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與啟動子上的 SRE-1 結(jié)合，在 Sp1 的協(xié)同作用下激活轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取膽固醇[17-18]。

固醇依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是調(diào)節(jié) LDLR 表達(dá)的重要方式，促進(jìn)了相關(guān)藥物開發(fā)和應(yīng)用。如目前臨床應(yīng)用廣泛的他汀類藥物通過競爭性抑制羥甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶的活性，減少胞內(nèi)膽固醇合成，反饋性激活的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)血漿內(nèi) LDL-C 內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[4]。

2.2 非固醇依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

SRE-1/SREBP 途徑作為固醇依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制已逐漸被闡明。此外研究人員發(fā)現(xiàn)了一類新的調(diào)控通路，即通過不依賴細(xì)胞內(nèi)固醇變化的方式激活的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究加深了人們對 LDLR 表達(dá)的認(rèn)識，有利于拓寬新藥開發(fā)的思路。

研究發(fā)現(xiàn)抑瘤素 M（oncostatin M，OM）、激素和第二信使等介質(zhì)通過非固醇依賴的方式調(diào)控的轉(zhuǎn)錄，此調(diào)控方式不受固醇變化的影響，而是通過獨立于 SRE-1/SREBP 的途徑，或通過非固醇因素激活 SREBP-2 的途徑來調(diào)控的轉(zhuǎn)錄。目前比較明確的幾種途徑有細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路、雌激素受體（estrogen receptor，ER）依賴的途徑、磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，Akt）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）通路等。

2.2.1 ERK 途徑 研究發(fā)現(xiàn)激活 ERK 通路可促進(jìn) LDLR 的轉(zhuǎn)錄。ERK 是將信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至核的關(guān)鍵，其激活涉及有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，即 Ras-Raf-MAPK 激酶（MAPK kinase，MEK）-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，又稱 ERK 通路。Ras 被刺激因子激活后，下游的 Raf、MEK 和 ERK 依次被磷酸化激活，并促進(jìn) cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化[19]。OM 和部分生長因子等因素可通過激活 ERK 通路促進(jìn) LDLR 的轉(zhuǎn)錄。

OM 是一種細(xì)胞因子，體內(nèi)外實驗證實其以非固醇依賴的方式調(diào)控的轉(zhuǎn)錄[20-21]。Liu 等[14]發(fā)現(xiàn)啟動子上 C/EBP 位點和 CRE 這兩種 SIRE 的突變完全消除了 OM 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) OM 可募集轉(zhuǎn)錄因子早期生長應(yīng)答因子 1（early growth response gene product 1，EGR-1）和C/EBPβ到 SIRE 上，共同促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄[22-23]。EGR-1 和 C/EBPβ 均為 ERK 通路的下游效應(yīng)元件，提示此調(diào)控依賴于 OM 對 ERK 信號的激活作用。Li 等[24]證實，ERK 通路是 OM 激活轉(zhuǎn)錄的必要因素，并首次證明了 repeat 3 是 OM 響應(yīng) ERK 激活的一個靶點。此外，MEK 抑制劑 U0126 成功阻斷了 OM 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步了證實了 ERK 通路在其中的作用[25]。ERK 的激活促使 C/EBPβ 發(fā)生磷酸化，使得其與 EGR-1 的結(jié)合更加緊密，促使 SIRE 處的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的形成，加速了的轉(zhuǎn)錄[25]。

此外，有研究表明包括胰島素、胰島素樣生長因子 1 和血小板衍生生長因子等在內(nèi)的生長因子通過激活 ERK 通路提高了 SREBPs 的表達(dá)水平，繼而促進(jìn)了的轉(zhuǎn)錄[26]。

2.2.2 ER 依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 ER 是類固醇激素受體超家族中的一員，與雌激素結(jié)合后以二聚體形式發(fā)生核轉(zhuǎn)位，隨后與靶基因的雌激素反應(yīng)元件（estrogen responsive element，ERE）結(jié)合或與其他特定轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[27]。由于啟動子區(qū)不含保守的 ERE，因此 ER 不可直接作用于，有研究發(fā)現(xiàn)，ER 通過與 Sp1 結(jié)合后作用于啟動子區(qū)的 repeat 1 或 3，以此促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[28]。

雌激素可刺激 LDLR 的表達(dá)[29]。用乙炔雌二醇給藥后大鼠肝臟mRNA 呈劑量依賴性增高，在劑量為2000 μg/d 時升高至 7 倍，且此變化與食物攝入無關(guān)[30]。在 HepG2 細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)論[31]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，在外源性 ER 存在的情況下 17β-雌二醇可激活的轉(zhuǎn)錄，而 ER 拮抗劑可阻斷此激活作用[32]。越來越多的證據(jù)表明，雌激素以 ER 依賴的方式促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，但其分子基礎(chǔ)尚未闡明[28]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)雌激素的降膽固醇作用在切除垂體后的大鼠體內(nèi)被顯著減弱，而生長激素的補充逆轉(zhuǎn)了這一消減作用，提示生長激素可能在此調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[33]。

雌激素對早期 AS 的預(yù)防作用在多種動物模型中得到證實，而 ER 是雌激素發(fā)揮抗 AS 作用的關(guān)鍵靶點[34-35]。

2.2.3 PI3K-Akt-mTORC 途徑 Akt 是PI3K 的重要下游效應(yīng)蛋白，對維持多種細(xì)胞過程的正常功能至關(guān)重要。PI3K 介導(dǎo)生成的三磷酸磷脂酰肌醇（phosphoinositide-3,4, 5-trisphosphate，PIP3）特異性識別 Akt 上的普列克底物蛋白同源域（pleckstrin homology domain，PHD）并將 Akt 招募到細(xì)胞膜，使其在 mTORC 等作用下被活化[36]。此通路影響 SREBP-2 的裂解激活，但影響效果及具體機制仍有待研究[37]。通過研究 Akt 抑制劑 MK-2206 對肝細(xì)胞 LDLR 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn) MK-2206 可誘導(dǎo) SREBP-2 蛋白的裂解過程并促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄，且與胞內(nèi)固醇水平無關(guān)[38]。目前的研究提示了 Akt-SREBP-LDLR 途徑在糖脂代謝中可能發(fā)揮了重要作用[39]。

2.2.4 其他途徑 肌醇 1,4,5-三磷酸鹽（inositol 1,4,5-triphosphate，IP3）-Ca2+途徑被證實與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。體外實驗通過 Ca2+載體 A-23187 模擬人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（human monocytic leukemic cell line，THP-1）和人肝癌細(xì)胞系 HepG2 中 IP3 的影響，發(fā)現(xiàn) A-23187 的加入使得的 mRNA 水平顯著提升，且轉(zhuǎn)錄速率增加；而預(yù)先用放線菌素 D 處理后mRNA 的增長作用被消減[40]。這表示 IP3-Ca2+途徑對的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄層面，且與固醇水平無關(guān)。Kartawijaya 等[41]發(fā)現(xiàn)染料木素（genistein）可能通過激活 c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）信號促進(jìn) SREBP-2 的裂解，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào) LDLR 的表達(dá)。金合歡素（acacetin）也可能通過非固醇依賴的方式上調(diào)SREBP-2 進(jìn)而促進(jìn) LDLR 的表達(dá)，具體機制有待進(jìn)一步闡明[42]。此外，cAMP 通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的mRNA 水平。有研究發(fā)現(xiàn)二丁酰環(huán)腺苷酸（dbcAMP）降低了培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的 LDLR 活性[43]。也有研究用 dbcAMP 處理 THP-1 細(xì)胞使得的轉(zhuǎn)錄水平提升了 4 倍[40]。

通過激活與固醇無關(guān)的調(diào)節(jié)通路也可以促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄，這為藥物開發(fā)和臨床治療提供了更為廣闊的治療方向。但目前有關(guān)此方面的研究較為缺乏，具體機制仍不明確。

3 LDLR 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后水平對 mRNA 穩(wěn)定性的調(diào)控在哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)中起重要作用，可快速調(diào)整基因表達(dá)以響應(yīng)環(huán)境條件的變化。mRNA 的相對穩(wěn)定性較差，半衰期約為 2 h[44]。已知 mRNA 穩(wěn)定性由 3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）的調(diào)節(jié)序列決定，此區(qū)域長約 2.5 kb，包含 4 個富含 AU 序列的元件（AU-rich elements，AREs）[44]。3'-UTR 通過與 RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）或微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）相互作用來反式調(diào)控基因的表達(dá)。

3.1 RBPs 介導(dǎo)的LDLR mRNA 穩(wěn)定性調(diào)控

RBPs是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可直接或間接地與順式作用元件結(jié)合來調(diào)節(jié) RNA 的代謝并影響基因表達(dá)[45]。而 ARE 是影響 mRNA 穩(wěn)定性的最重要的順式作用元件，可與一系列 RBPs 結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA 的降解[46]。

某些 RBPs 可促進(jìn) mRNA 降解，如靶向于 ARE 的 KH 型剪接調(diào)控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KSRP）和異質(zhì)性胞核核糖核蛋白D（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，hnRNP D）[47]。小檗堿（berberine，BBR）是一種作用機制與他汀類藥物不同的新型降血脂藥物[48]。BBR 及其代謝物在轉(zhuǎn)錄后水平增加mRNA 的穩(wěn)定性，使其半衰期顯著延長[49]。研究發(fā)現(xiàn) BBR 可降低不穩(wěn)定因子 KSRP 和 hnRNP D 與 ARE 序列的結(jié)合能力，從而有效鞏固了 mRNA 的穩(wěn)定性[50]。此外，某些 RBPs 可增加mRNA 的穩(wěn)定性，如靶向于 ARE 的人類抗原 R 蛋白（human antigen R，HuR）。HuR 是胚胎致死異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族中廣泛表達(dá)的蛋白，定位于細(xì)胞核，在應(yīng)激狀態(tài)下易位至細(xì)胞質(zhì)并與靶基因的 ARE 序列結(jié)合，從而增加其 mRNA 穩(wěn)定性[51]。5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5-aminoimidazole-4- carboxamide ribonucleoside，AICAR）可誘導(dǎo)肝細(xì)胞中 LDLR mRNA 水平升高，研究發(fā)現(xiàn)此作用是通過促進(jìn) HuR 與 ARE1 結(jié)合以提高 mRNA 穩(wěn)定性來介導(dǎo)的[52]。

3.2 miRNAs 介導(dǎo)的LDLR mRNA 穩(wěn)定性調(diào)控

miRNAs 是一類由大約 22 個核苷酸組成的小分子非編碼 RNA，主要通過與靶基因mRNA 的 3'-UTR 結(jié)合致使 mRNA 降解，由此調(diào)控了哺乳動物多達(dá) 30% 的蛋白質(zhì)編碼基因的活性，被認(rèn)為是真核生物基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[53]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 LDLR 表達(dá)，在控制膽固醇和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中有重要作用[54]。的 3'-UTR 序列上含有多個潛在的 miRNA 結(jié)合位點，研究發(fā)現(xiàn) miR-185、miR-199a、miR-148a、miR-128-1、miR-130b 和 miR-301 等直接靶向于3'-UTR 來調(diào)控人和小鼠肝細(xì)胞中 LDLR 的表達(dá)[55]。其中，miR-185 及其抑制劑均被發(fā)現(xiàn)有抑制 LDLR 表達(dá)的作用，本課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) miR-185 除靶向于3'-UTR 而直接影響其表達(dá)外，還靶向于促進(jìn) LDLR mRNA 降解的 RNA 結(jié)合蛋白 KSRP 從而間接影響其表達(dá)，由此揭示了一種新的 AS 相關(guān)的前饋環(huán)路[56]。此外，miRNA 介導(dǎo)的對 SREBP-2 的調(diào)控可能代表了參與 LDLR 表達(dá)調(diào)控的另一方式[54]。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) miR-185 可促進(jìn)的 mRNA 降解繼而在轉(zhuǎn)錄水平抑制 LDLR 的表達(dá)，闡明了其在機體和細(xì)胞水平上嚴(yán)格調(diào)控膽固醇代謝的新機制[57]。miRNA 的發(fā)現(xiàn)揭示了真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性，并為研究 LDLR 表達(dá)的調(diào)控機制提供了新的思路。在體內(nèi)操縱 miRNA 表達(dá)可能是治療血脂異常和相關(guān)心血管疾病的有效治療策略，值得深入研究。

3.3 調(diào)控 LDLR mRNA 穩(wěn)定性的化合物

近年研究發(fā)現(xiàn)一些化合物對mRNA 的穩(wěn)定性有重要影響，為開發(fā)降低血漿 LDL的藥物開辟了新的途徑。

酯--乙酸酯（phorbol-12-myristate- 13-acetate，PMA）是一個可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 LDLR 表達(dá)的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，在具有完整肌動蛋白細(xì)胞骨架的前提下，PMA 可延長肝細(xì)胞mRNA 的半衰期；而在細(xì)胞骨架的完整性被破壞時，mRNA 的穩(wěn)定性達(dá)到了與上述 PMA 處理后的相同程度，且后續(xù)加入 PMA 對穩(wěn)定性沒有影響[58]。這表示的 mRNA 穩(wěn)定性可能與細(xì)胞骨架成分有關(guān)。進(jìn)一步研究表明 PMA 介導(dǎo)的mRNA 的穩(wěn)定需要 3'-UTR 序列[59]?？赡艿囊环N解釋是，3'-UTR 中的序列與細(xì)胞骨架的連接可能會使 mRNA 變得不穩(wěn)定，而 PMA 可能通過引起細(xì)胞骨架降解或通過保護 3'-UTR 上的連接位點來增加 mRNA 穩(wěn)定性[59]。

鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）是天然的疏水性初級膽汁酸，即使在可抑制 LDLR 表達(dá)的 25-羥基膽固醇存在時，也可顯著提高 HepG2 細(xì)胞中的 mRNA 水平[60]。CDCA 被證實通過作用于 ARE1 來調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性，并伴有 ERK 通路的激活[61]。這表示膽汁酸及其衍生物可能在調(diào)控 LDLR 表達(dá)方面有重要作用，有待進(jìn)一步研究。

天然產(chǎn)物 BBR 通過 ERK 通路介導(dǎo)mRNA 的穩(wěn)定性調(diào)控[62]。Kong 等[48]通過MEK 抑制劑 U0126 及 p38、PI3K 和 JNK 等酶的抑制劑來阻斷 MAPK 亞型的激活，發(fā)現(xiàn) BBR 提高mRNA 水平的作用被 U0126 消除，進(jìn)一步證明了此機制。

體內(nèi)外實驗表明 Akt 抑制劑 triciribine 以 ERK 依賴的方式增加mRNA 的穩(wěn)定性。Triciribine 在有無固醇存在的條件下均可上調(diào) HepG2 細(xì)胞中mRNA 水平，且用放線菌素 D 檢測發(fā)現(xiàn) mRNA 的半衰期增加約 2.5 倍，但此作用在 U0126 的作用下失效[63]。有研究發(fā)現(xiàn) Akt 可磷酸化 Raf 來抑制 ERK 的激活[64]。Triciribine 可能通過減輕 Akt 對 Raf 的抑制作用，從而使 ERK 下游激活，穩(wěn)定mRNA。不同 Akt 亞型可能對 LDLR 表達(dá)產(chǎn)生不同的影響，研究發(fā)現(xiàn) Akt2 與mRNA 的穩(wěn)定性有關(guān)[65]。

4 LDLR 翻譯后水平的調(diào)控

LDLR 表達(dá)在蛋白水平的調(diào)節(jié)也是影響脂蛋白代謝的決定因素之一，目前已證實有兩種有效的 LDLR 調(diào)節(jié)蛋白，分別是 LDLR 誘導(dǎo)降解蛋白（inducible degrader of the ldlr，IDOL）和 PCSK9。其中，IDOL 以肝 X 受體（liver X receptor，LXR）-IDOL-LDLR 的泛素化途徑在細(xì)胞內(nèi)起作用，而 PCSK9 主要通過與 LDLR 胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo) LDLR 的降解。

4.1 LXR-IDOL-LDLR 途徑

2009 年，IDOL 途徑被確定為一種全新的在蛋白水平調(diào)控 LDLR 表達(dá)的方式[66]。IDOL具有 E3 泛素連接酶活性，可引發(fā) LDLR 泛素化而使其進(jìn)入溶酶體被降解，這是一種與網(wǎng)格蛋白無關(guān)的內(nèi)吞途徑[67]。IDOL 包含兩個不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，即一個氨基末端 FERM 和一個羧基末端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域。其中 IDOL 與 LDLR 的結(jié)合依賴于 FERM 域，而環(huán)狀結(jié)構(gòu)域刺激 LDLR 的泛素化[66]。IDOL 受到固醇感應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子 LXR 的直接調(diào)控，在細(xì)胞中固醇水平豐富時，LXR 激活并誘導(dǎo) IDOL 表達(dá)，由此顯著降低 LDLR 的蛋白水平從而阻止外源性膽固醇的攝入。泛素化修飾是可逆的，泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，USP）家族是人體基因編碼的去泛素化酶中最大的家族。研究發(fā)現(xiàn) USP2可抵消 IDOL 的泛素化作用，且去泛素化過程不受固醇水平的影響[68]。

體內(nèi)外研究表明，IDOL 的減少會增加 LDLR 的蛋白水平[69]。而腺病毒介導(dǎo)的 IDOL 過表達(dá)對–/–小鼠血漿膽固醇水平和脂蛋白譜沒有顯著影響，進(jìn)一步證明 IDOL 通過介導(dǎo) LDLR 的表達(dá)來影響膽固醇水平[66]。LXR-IDOL-LDLR 途徑定義了一個與獨立于 SREBP-2 的調(diào)控途徑，是防治血脂異常和脂代謝紊亂的潛在靶點[70]。

4.2 PCSK9 介導(dǎo)的途徑

PCSK9 是一種分泌型蛋白，主要在肝臟、小腸和腎臟中表達(dá)，結(jié)構(gòu)上含有一個前肽結(jié)構(gòu)域、一個催化結(jié)構(gòu)域和一個富含組氨酸的羧基末端結(jié)構(gòu)域[71]。PCSK9 的催化域與 LDLR 的 EGF-A 在細(xì)胞表面緊密結(jié)合，通過網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)運至內(nèi)體。PCSK9 與 LDLR 的緊密結(jié)合導(dǎo)致 LDLR 的蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使得 LDLR 在內(nèi)體的酸性環(huán)境下仍無法與 PCSK9 解離從而阻止其返回細(xì)胞膜，并以復(fù)合物形式進(jìn)入溶酶體被降解[72-73]。PCSK9 的發(fā)現(xiàn)使我們對機體膽固醇代謝的理解從一個完全由細(xì)胞內(nèi)過程控制的系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€由循環(huán)蛋白調(diào)節(jié)的系統(tǒng)。

有研究在野生型和基因突變小鼠肝臟中過表達(dá) PCSK9，發(fā)現(xiàn)兩種小鼠的肝臟LDLR 蛋白水平均大幅下降，而mRNA 水平未顯著降低，說明 PCSK9 可能通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi) LDLR 表達(dá)[74]。此外，細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn) HepG2 細(xì)胞和 HEK-293 細(xì)胞中 PCSK9 的表達(dá)可顯著降低 LDLR 水平，而在成纖維細(xì)胞和 CHO 細(xì)胞中 PCSK9 對 LDLR 表達(dá)的影響較小，說明 PCSK9 的作用可能需要細(xì)胞中特定的響應(yīng)因子[75]。9 是 SREBP-2 的靶基因，受到 SREBP-2 的調(diào)節(jié)。已知他汀類藥物通過抑制 HMG-CoA 還原酶活性來促進(jìn) SREBP-2 表達(dá)，從而使 LDLR 表達(dá)水平增加。但同時 PCSK9 表達(dá)的增加可通過促進(jìn) LDLR 降解來減弱藥物的功效，因此 PCSK9 代表了 SREBP 途徑中限制 LDLR 活性的有效反作用機制[76]。PCSK9 的功能與 LDLR 水平之間形成了明確的聯(lián)系，PCSK9 成為降低心血管病發(fā)病率的重要藥物靶點，對其抑制劑的開發(fā)成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點，人源化 PCSK9 抗體已率先獲批用于臨床。

圖 2 人LDLR 基因的表達(dá)調(diào)控機制

5 展望

LDLR 的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯后水平受到多種途徑的調(diào)控，參與維持血漿中 LDL-C 水平的相對穩(wěn)定（圖 2）。LDLR 表達(dá)及功能失調(diào)使得肝臟對血液循環(huán)中 LDL-C 的清除能力下降，導(dǎo)致 AS 發(fā)生和發(fā)展，因此調(diào)控 LDLR 的表達(dá)是減少全球心血管疾病負(fù)擔(dān)的重要策略。上調(diào) LDLR 表達(dá)可有效降低 LDL-C 水平，相關(guān)藥物如他汀和 PCSK9 抑制劑的出現(xiàn)有效減少了心血管事件的發(fā)生。

他汀類藥物是降脂治療的一線藥物，通過抑制內(nèi)源性膽固醇合成繼而由 SREBP 途徑在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn) LDLR 的表達(dá)，可將五年內(nèi)主要冠狀動脈事件的發(fā)病率降低五分之一[77]。但因存在療效個體差異及橫紋肌溶解等副作用而具有一定的治療局限性[78]。PCSK9 抑制劑為降脂治療提供了更多選擇，通過抑制 PCSK9 表達(dá)或阻止 PCSK9 與 LDLR 相互作用從而抑制 PCSK9 介導(dǎo)的 LDLR 降解[79]。目前已上市的兩種 PCSK9 抑制劑alirocumab 和 evolocumab 均為人源化單抗，其療效和安全性得到大量臨床數(shù)據(jù)證實，但由于價格昂貴而阻礙了大規(guī)模應(yīng)用[80]。PCSK9 小分子抑制劑的成本效益和給藥方式較為理想，但因受到結(jié)合表面平坦、小分子與靶蛋白相互作用復(fù)雜等影響而開發(fā)難度較大，目前仍處于臨床前研發(fā)階段[81]。本課題組篩選到一種潛在的 PCSK9 小分子轉(zhuǎn)錄抑制劑 7030B-C5，可降低小鼠 PCSK9 水平并促進(jìn) LDLR 表達(dá)[82]。總之，LDLR 的表達(dá)調(diào)控機制研究將加深對 LDLR 的功能調(diào)控和抗 AS 機制的理解，為新機制降脂藥物的研發(fā)提供新的思路。

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國家自然科學(xué)基金（81402929）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2017-I2M-1-008）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09711001-007-002）；北京市自然科學(xué)基金（7162129）

杜郁，Email：duyu@imb.pumc.edu.cn；洪斌，Email：binhong69@hotmail.com

2020-04-30